【原】基因递送系统｜第1期. 慢病毒基因递送系统你了解吗？

新用户4064dVjo 2023-07-22 发布于北京

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一．慢病毒系统介绍

慢病毒（Lentivirus）载体是一种单链RNA病毒，是以人类免疫缺陷型病毒1（HIV-1）为基础发展起来的基因治疗载体。HIV病毒基因组由两条正义链的RNA组成，约9kb的序列编码了9个蛋白，分别是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三个最大的阅读框编码了三个最主要的结构蛋白：gag、pol和env。

慢病毒载体能高效的将目的基因，RNAi或Cas9-gRNA导入人和动物的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白，产生RNAi干扰或基因敲除。慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。

二．慢病毒系统构成

我们通常用的慢病毒系统是重组假型慢病毒，包含慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

三．慢病毒系统的发展

由于慢病毒载体来自HIV-1病原体，有可能通过宿主细胞中的内源性病毒元件和外源基因之间的重组，产生具有复制能力的慢病毒(RCLs)。为了创造安全的慢病毒使用系统，慢病毒系统经过了三次迭代。

1.第一代慢病毒系统

第一代病毒系统将病毒基因组分成三个独立的质粒：①包装质粒；② 编码病毒糖蛋白的包膜质粒；③ 包含目的基因的载体质粒。包装质粒包含病毒包装所必需的HIV Gag、Pol和CMV启动子控制下的调控/辅助蛋白。包膜质粒表达病毒糖蛋白如VSV-G，为载体提供受体结合蛋白。为了降低载体制备过程中产生具有复制能力的慢病毒的可能性，LTRs，包装信号ψ，以及RRE都包含在载体质粒中。将负责包装病毒DNA的基因组成分与激活病毒DNA的基因组成分分离开来。因此，包装序列不含病毒基因组，病毒在感染宿主细胞后也不会复制。

2.第二代慢病毒系统

由于第一代重组慢病毒载体还是存在一定生物安全风险，目前已不再广泛使用，第二代慢病毒系统应运而生。在该系统中，调控HIV在宿主细胞内繁殖的基因组成分(Vif、Vpu、Vpr或Nef)被去除。因此，第二代重组系统只包含9个HIV基因中的4个基因：gag、pol、tat和rev。第二代慢病毒的载体质粒必须与第二代包装质粒一起使用，因为LTR的转基因表达是Tat依赖性的。

3.第三代重组慢病毒载体

第三代重组慢病毒载体系统有四个质粒构成: ① 包装质粒：只含有gag和pol基因的; ② 包膜质粒(即VSV-G); ③ 调控质粒表达Rev; ④ 由异源强启动子驱动的载体质粒。

传统的慢病毒载体通过两侧LTR，将LTR之间的转基因序列(包括LTR)整合到宿主基因组中。然而，完整的LTRs也带来了潜在的安全风险。如果偶然产生了具有复制能力的重组慢病毒，它们可以像野生型病毒一样进行复制；其次，载体转导的细胞可能被野生型慢病毒感染，野生型慢病毒可以作为一种辅助病毒，将整合的载体挽救成新的病毒颗粒进行复制；另外，LTRs有一个增强子和启动子区域，将LTRs整合到基因组中可以激活邻近的基因（如原癌基因），基于此，人们开发了第三代自我失活(SIN)的慢病毒载体系统。在第三代重组慢病毒系统中，将3'-LTR中作为增强子/启动子的U3区域删除，这样，在慢病毒逆转录过程中，U3缺失会被复制并整合到基因组的5'-LTR启动子/增强子区域，即使被转导细胞中存在潜在的可包装病毒基因组，也无法激活转录。Tat和Rev对于HIV-1的复制是必需的，它们调节病毒转录和转录本向细胞核外的输出。因此，为了提高安全性，Tat从第三代慢病毒系统的包装质粒中删除，同时，通过将载体质粒5'-LTR的U3启动子区，替换为其他病毒(如CMV或RSV)的强启动子，来实现Tat的功能。而Rev是由另一个单独的调控质粒提供，以增加安全性。

由于慢病毒载体系统被拆分成四个质粒，至少需要三个重组事件才能产生具有复制能力的类HIV-1病毒。而且即使发生病毒重组，产生的病毒只有Gag，Pol，Rev和VSV-G蛋白，没有功能性LTR，Tat或辅助蛋白，这样可以显著增加载体的安全性。然而，与传统三质粒系统（即第二代）相比，第三代载体的病毒产量相对较低。