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文章信息 论文标题：Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals atissue-resident memory subset associated with improved prognosis 刊登日期：2018年7月 发表杂志：Nature Medicine 影响因子：32.621 研究机构：澳大利亚墨尔本大学 样本类型：乳腺癌原发灶和转移灶样本TIL 技术手段：单细胞测序（10X Chromium）、转录组测序、TCR-β测序、流式分选 前言 乳腺癌（BC）中肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的数量是改善患者存活的有力预后因素，特别是在三阴性和HER2过表达的BC亚型中。尽管T细胞是TIL的主要群体，但T细胞亚群的定量和定性差异与患者预后之间的关系仍然未知。作者对从人BC中分离的6,311个T细胞进行了单细胞RNA测序，显示了TIL细胞群中存在显著异质性。研究证明含有大量TIL的BC中含有CD8+T细胞，其具有组织驻留记忆T（TRM）细胞分化的特征，并且这些CD8+ TRM细胞表达高水平的免疫检查点分子和效应蛋白。单细胞测序数据开发的CD8+ TRM基因信号与早期三阴性乳腺癌（TNBC）中患者存活率的改善显著相关，并且提供了比单独CD8表达更好的预后。数据表明CD8 + TRM细胞有助于BC免疫监视，并且是免疫检查点抑制调节的关键目标，因此进一步了解TRM细胞的发育，维持和调节对于BC的成功免疫治疗发展至关重要。 研究结果 作者通过FASC对123例乳腺癌患者的129个原发灶（84个）和转移灶（45个，淋巴转移和远端转移）组织进行了TILs（CD45+）分选，并对TILs构成和T细胞亚群进行分析，发现三种乳腺癌（TNBC、HER2+、luminal）亚型的原发灶中TILs整体比例显著高于转移灶（图1 a），CD3+ T细胞是主要的TIL群体（图2 a），且CD3+ T细胞含量与CD4/CD8比值负相关（图2 b）。在CD3+CD8+和CD3+CD4+T细胞中，效应记忆T细胞（TEM, CD45RA–CCR7–)比例最高，其次是CD45RA+CCR7– (TEMRA)（图2 d）。 研究报道晚期乳腺癌对pembrolizumab（派姆单抗）和atezolizumab（阿特珠单抗）的响应效果与TIL数量有关，为了更好地理解这一结论，作者对乳腺癌TIC亚群免疫检查点基因表达进行了分析，发现乳腺癌TIL中，CD3+CD8+和CD3+CD4+ T细胞均高表达PD-1，且CD4+ T细胞中CTLA-4（Cytotoxic T lymphocyte–associated protein-4）表达高于CD8+T细胞（图1 b），没有T细胞表达TIM-3（T cell immunoglobulin and mucin domain–containing3）或LAG-3（lymphocyte-activationgene-3）（图2 c）。 图1 图2 作者对来自两例原发TNBC患者的6311个CD3+CD45+T细胞进行了单细胞转录组测序（图3 a），经过数据过滤后对5759个细胞进行聚类分析，共获得了10个细胞类群，包括三个CD8A+T细胞聚类和四个CD4+T细胞聚类（图3 b、c）。在CD8A+ T聚类中，存在一个TRM细胞（tissue-resident memory T cell，CD8A+CD103+）群体，TRM和其他CD8A+T相比有400个基因显著差异（FDR<0.01），包括高表达CD103和低表达SELL、KLRG1、KLF2、S1PR1、S1PR5。另外一些免疫检查点基因，例如HAVCR2 (TIM3)、PDCD1 (PD1)、CTLA4, TIGIT、LAG3等，也在TRM 高表达（图3 d）。拟时序分析发现TRM和TEM位于时序路径两端，表明两种类型细胞基因表达差异很大（图3 f）。 图3 作者使用流式评估了123例乳腺癌患者的129个原发灶中CD8+T细胞的CD103表达情况，发现绝大部分CD8+ T表达CD69，有一部分CD8+T表达CD103，免疫荧光证明了CD8+ T细胞表达CD103（图4 e），而且CD8+CD103+T细胞数量比CD4+CD103+数量更多（图4 c），PD-1高表达时CD8+CD103+T细胞比例也更高（图4 d），这些数据表明CD8+CD103+T细胞群体在富含TILs的乳腺癌样本中富集。 图4 为了确认人乳腺癌CD8+CD103+ T细胞与TRM类别细胞的一致性，作者选择另外两例原发TNBC患者和1例肝转移TNBC患者的新鲜肿瘤样本，分选出CD8+CD103+和CD8+CD103-T细胞后转录组测序(bulk RNA-seq)，共鉴定到534个显著性差异基因（FDR<0.05），CD8+CD103+细胞群体中组织离开基因（tissue egress genes）S1PR1和KLF2低表达而PD1和CTLA4高表达（图5 a），基因表达聚类和GSEA分析均表明CD8+CD103+和TRM具有高度相似性（图5 b、c）。 图5 为了研究CD8+CD103+ T细胞的功能特征，作者将TILs和自体乳腺癌细胞体外共培养，在TCR刺激下，CD8+CD103+T细胞表达更多的颗粒酶B（granzyme B）（图6 左），同时也发现TILs分泌granzyme B和RANTES (CCL5)不依赖于CD3/CD28刺激，但是γ型干扰素的分泌需要CD3/CD28刺激（图6 右）。这些数据表明人TNBCs源的CD8+CD103+ T细胞具有细胞毒性能力和促炎潜力。 图6 作者对bulk RNA-seq使用的样本继续做了TCR-β测序，发现TRM具有更高的TCR克隆（TRM平均0.2个克隆，TEM平均0.11个克隆），两个原发灶样本中TRM和TEM间无共同TCR克隆（重复率>0.5%），而在转移灶样本中有一部分重复（箭头标注）（图7）。这些数据表明CD8+CD103+ TRM样细胞和TEM相比具有不同的抗原特性。 图7 研究数据显示CD8+CD103+TRM细胞亚群是TNBCs微环境中的主要效应细胞群体，作者推测了TRM细胞基因表达信号会为预后提供重要的信息。分析发现和CD8相比（图8 c、d），TRM细胞基因信号与329例经标准免疫治疗后、原发TNBC患者的无病生存期和总生存期显著相关相关（图8 a、b），并且患者CD8高表达时，TRM细胞基因信号也能提供不同的预后信息（图8 e）。和CD8、CD3、CD103单细胞表达信息以及TH1、TH1、STAT1相比，TRM细胞基因信号与更好的预后显著相关，并且具有更低的风险比（图8 f），并且TRM细胞基因信号在TNBC中表达高于其他乳腺癌亚型（图8 g），这些数据表明CD8+ TRM细胞可能是改善高含量TIL乳腺癌细胞临床结果的关键介质。 图8 原发性乳腺癌活检组织中TIL数量显著高于转移性乳腺癌活检组织，表明复发性乳腺癌具有较差的免疫原性，在此情况下对于以后改进检查点抑制是一个重大挑战。文章研究数据表明，TRM细胞具有细胞毒性潜力，T细胞检查点高表达和明显的细胞增殖能力等特性，预示TRM细胞细胞可能是乳腺癌患者免疫治疗调节的关键靶标，而体内发生这种情况的直接或间接机制尚不清楚。TRM细胞可通过直接细胞毒性或促炎细胞因子以及趋化因子的释放来响应检查点抑制，所述促炎细胞因子和趋化因子产生创造了一个宽容的免疫微环境。为了支持这一点，作者对来自45名接受过免疫检查点阻滞治疗的患者的68个黑色素瘤样本进行了基因表达集分析，发现在基线时响应者的TRM基因信号显着富集，同时在用抗PD-1剂nivolumab治疗期间活检组织中这些基因与基线相比显著上调（图8 h）。 |
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