北京林业大学林金星团队发表活体检测蛋白互作技术方面综述论文

祥强6csdm0n3vs 2019-03-17

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近日，北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心/生物学院林金星研究团队在综合学术期刊SCIENCE CHINA Life Sciences 发表了题为The detection techniques for protein-protein interaction in vivo: principle, limitations and recent progress 的综述文章。该综述系统的总结了多种用于活体生物体内检测蛋白质互作的生物技术，为研究者今后选择最佳活体蛋白互作检测方法提供参考。

分析蛋白质-蛋白质相互作用，不仅可以从分子水平上阐释蛋白质功能，而且有助于揭示细胞内信号转导过程的分子机理。传统检测蛋白互作的技术（包括：pull-down, 酵母双杂交和Co-IP等）大多是在非活体状态中进行，具有一定的局限性，因而无法提供活细胞内特定的时空信息。随着生物技术的发展，开发出了多种可用于活体生物体内检测蛋白质互作的新技术，包括：FRET，BRET，BiFC和基于co-localization and co-tracking等，这些技术克服了非活体状态分析蛋白互作的局限性，为研究蛋白互作提供了新的方法。

图1：基于PCAs技术检测蛋白互作示意图

该论文重点介绍了活体检测蛋白互作的三类技术，包括基于共振能量转移的分析技术、蛋白片段互补技术和基于co-localization and co-tracking的分析技术，并对每种技术的原理、局限性以及发展进行了总结。

能量共振转移技术（Resonance Energy Transfer，RET）是指两种不同分子在合适距离发生能量转移的现象，这个距离大约在1-10nm之间。传统的RET技术包括荧光共振能量转移（FRET）和生物发光共振能量转移（BRET）。这两种技术可以在无损细胞的状态下，实时监测细胞内蛋白质间的相互作用。但传统的RET技术存在一定的局限性，例如不能用于检测蛋白的荧光寿命以及多于两个的蛋白之间的相互作用等。因此，该综述除了介绍传统RET技术的原理及优缺点以外，重点介绍了基于传统RET技术新开发的检测蛋白互作的技术，譬如single-molecule FRET (smFRET), FRET-fluorescence lifetime imaging microscopy (FRET-FLIM), SRET (BRET-FRET)等，并对这些新技术的原理、优点、局限性及其应用进行了比较。

该综述第二部分重点阐述了以蛋白片段互补分析技术（protein fragment complementation assay，PCA）为基础研究蛋白相互作用的技术，主要包括双分子荧光互补技术(BiFC)，例如把YFP荧光蛋白分成nYFP和cYFP两部分，然后将两个检测蛋白A和B分别与nYFP和cYFP构成融合蛋白A-nYFP和B-cYFP，最后通过瞬时表达检测YFP荧光表达情况，从而检测A和B蛋白的互作；基于荧光素酶的互补技术（The split luciferase system），把荧光素酶分成两部分nLuc和cLuc，然后将两个检测蛋白A和B分别与nLuc和cLuc构成融合蛋白A-nLuc和B-cnLuc，最后通过瞬时表达检测luciferase酶活情况，从而来判断A和B蛋白的互作。该部分不仅介绍了目前传统PCA研究进展，还归纳总结了不同PCA方法之间的差异以及优缺点，并阐述了使用不同PCA时应注意的事项。本综述除了介绍传统的PCA原理和缺陷外，还进一步综述了PCA和其它蛋白检测技术联用的方法，如：BiFC-based FRET和the biotin identification (BioID)，并针对性的对其存在的优缺点以及使用范例进行了概述。此外，本部分还介绍了一种研究蛋白互作的最新技术：cytoskeleton-based assay for protein-protein interaction (CAPPI)，并概括了其原理和使用方法。

综述的最后一部分叙述的是基于co-localization and co-tracking检测蛋白互作的技术。近年来，越来越多的研究使用共定位分析技术来确定两个或多个蛋白可能发生的体内相互作用。简单来说，就是通过检测两个或多个不同荧光标记蛋白成像后图像共定位以及相关系数的计算，最终以相关性分析来确定其互作程度。过去，由于蛋白标记与成像技术的限制（例如：衍射极限、时空分辨率以及活体成像等），共定位只能粗略的间接反应蛋白互作情况，具有一定的局限性。随着荧光标记蛋白及其成像技术的发展，共定位技术判断体内蛋白互作精确程度有了大幅度的提升。在这里，作者重点介绍了近几年开发出的且更加适合连续、动态及高时空分辨的新型分析技术和检测方法，例如co-tracking of dual particles, single-molecule protein proximity index (smPPI), super-resolution co-localization, 3D colocalization, 3D dual-particle tracking等。这些技术的产生，不仅使蛋白互作检测可视化，且在高时空分辨率状态下真实还原了体内蛋白相互作用的本质，为今后研究生物体内蛋白互作提供了新思路。