百迈客医学检验所
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美国分子病理学学会（AMP）和美国病理学会（CAP）近日公布了基于二代测序（NGS）的肿瘤panels验证指南，以提高实验室测序结果的质量，为患者提供更好的临床医疗服务。具体指南发表于《The Journal of Molecular Diagnostics》杂志上，包括了靶向测序方法和数据分析的概述、新检测方法的注意事项以及试验验证和质量控制指标的实施建议。我们将对文章中的这4个方面进行解读。 靶向NGS方法概述 总体上，靶向NGS方法包括四个主要部分：样品制备，文库构建，测序，数据分析。 样品制备 临床肿瘤NGS分析的第一步是评估样本。对于血液标本，肿瘤细胞含量可通过单独的分析来推断。例如，通过外周血白细胞分类计数，或骨髓穿刺液流式细胞数据，可估计用于核酸提取的样本中肿瘤细胞的大致比例。 然而，对于实体肿瘤标本，则需要在进行NGS检测前由经过适当训练和认证的病理学家进行病理阅片。阅片可确保样本的肿瘤类型与预期一致，且存在足够量且未坏死的肿瘤细胞用于NGS分析。 阅片可被用于标注手工刮取或显微切割（如通过解剖镜）的区域，从而富集肿瘤细胞，提高基因变异检测的灵敏度。应该对肿瘤细胞比例进行估计，它在解释突变等位基因频率和拷贝数变异时提供了关键信息。然而，对肿瘤比例的估计完全取决于对苏木精-伊红染色切片的观察，染色易受多种因素的影响，且不同阅片者之间存在显著的经验差异。非肿瘤细胞，如炎性浸润和内皮细胞，通常小于肿瘤细胞，且与肿瘤紧密联结，可能以不明显的形式存在，导致对肿瘤比例的严重低估。 在严重炎症和坏疽的病例中，在估计肿瘤比例以及随后结合测序结果进行分析时，保持保守是非常重要的。对这类病例的突变等位基因比例（包括沉默突变）进行回顾，将能够对肿瘤细胞纯度进行更精确的估计，并对后续所需的检测提供更为准确的结果和建议。 文库构建 文库构建是指生成特定大小范围的DNA或cDNA片段的过程。肿瘤样本靶向NGS分析的建库方法主要有两种：杂交捕获法和扩增法。  杂交捕获NGS 基于杂交捕获的富集方法使用序列特异性的捕获探针，其与基因组上特定目标区域互补。探针是溶液形式的、经生物素标记的寡核苷酸序列，能够杂交并捕获预设的区域。捕获探针显著长于PCR引物，因此能够容忍结合位置存在多个错配，不会干扰与目标区域的杂交。此特点克服了在扩增法中常见的等位基因丢失问题。由于探针通常只结合目标区域，而DNA片段的长度比目标区域大得多，因此位于目标区域两侧的序列也会被分离出来并进行测序。与扩增法相比，杂交捕获法能够获得靶点附近区域的信息，这些区域可能不易被其本身的特异性探针捕获到。 然而，杂交捕获法也能够分离到非目标的邻近区域，如果非靶点区域的测序数据不能被有效地平衡，目标区域的总体覆盖度将下降。另外，在发生重排的病例中，分离到的“邻近区域”可能来自远离预期靶点的基因组区域。通过打断和其他方法获得的DNA片段的长度，将对实验结果产生很大的影响。一方面，较短的片段被捕获的特异性更高，因其包含较少的非目标序列。另一方面，与短读长相比，较长的读长在比对到参考序列时的不确定性较低。 目前杂交捕获技术已有商业化的实例，如Agilent SureSelect，Nimblegen和Illumina TruSeq。定制化的panel能够被设计成覆盖基因组大范围的区域（典型的panel从50个基因到几千个基因不等）。一旦目标区域被确定，靶区域的大小将决定用于捕获每个特定区域所需的探针数量。对于某些已经被证明难以富集的区域，可增加探针的密度。 杂交捕获富集法常用的样本制备步骤包括起始DNA的打断，随后是数个酶促反应步骤，包括末端修复，碱基A的添加以及序列接头的连接，PCR扩增及产物纯化。接下来，将NGS文库与定制的生物素标记的寡核苷酸捕获探针进行杂交。由于DNA打断具有随机性，每个被捕获的片段其大小和序列均不同。每个片段测序的结果与参考序列比对时将含有唯一的起点和终点。据此能够在测序数据集中识别并去除由PCR复制而来的冗余数据，更为精确地确定测序的覆盖深度和变异频率。 HaloPlex靶向富集系统（Agilent Technologies）是一种对上述杂交捕获法的改良方法。HaloPlex技术使用限制性内切酶消化基因组DNA，随后使用生物素标记的DNA探针进行杂交，探针仅设计在目标区域的5’端和3’端。这促进了目标区域的环化，提高了捕获特异性。这种探针/片段环化杂交物被链霉亲和素包被的磁珠所捕获，随后进行连接，纯化和扩增。 杂交捕获法对样本的碱基构成敏感。AT含量高的序列可由于较差的退火效果而丢失，而高GC含量的序列可由于二级结构的形成而丢失。 基于扩增的NGS 基于扩增的文库构建方法依赖于多重PCR扩增步骤，以富集目标序列。目标序列被样本特异性的标签所标记，测序接头可将扩增子与事先植入在测序平台底部的寡核苷酸链通过互补配对相锚定。依据目标区域引物和试剂盒的设计，建库扩增的步骤可为一步或两步PCR法。扩增建库法功能多，且具备可扩展性，可构建各种大小范围的文库（如Illumina的26基因TruSight Tumorpanel，Thermo Fisher的409基因AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel ）。通常扩增法比杂交捕获法所需的实验工作时间短。 基于扩增的建库方法容易受到PCR引物设计相关的化学因素的影响。例如，当序列的引物结合区域存在单核苷酸多态性或小的插入/缺失时，引物将发生错配或不能结合，从而导致等位基因丢失。这将会导致扩增子的覆盖度低于预期，若突变等位基因位于扩增子内，可能导致对突变频率的错误估计。 另外，扩增建库法在高GC含量的基因或高度重复序列区域可能效果较差。此外，若indel恰好将引物区域从基因组删除，或者较大地改变了扩增子的长度，扩增建库法将不能将indel检出。 最后，在扩增子的末端测序质量将下降，导致这些区域可能出现错误的检测结果。如果关键热点区域位于扩增子末端，此问题可通过拼接扩增改善，以保证具有重叠部分。 百迈客医学检验所 百迈客医学检验所专注于基因临床检测的服务和产品，主要方向为肿瘤和遗传病相关的个性化用药基因检测和早期发现与预防。包括基于ctDNA的无创肿瘤检测和实体瘤基因检测、单基因遗传病检测、疾病易感基因检测等产品。同时，百迈客医学不断地积极响应市场需求，陆续推出液体活检相关的基因检测产品，基因检测是精准医疗的核心组成部分，是实现个体化治疗的重要技术手段，对于提高治疗效果，降低病患痛苦有着重要意义。 百迈客医学将秉承严谨、专业的精神去践行我们的使命：解读基因，守护健康。 |
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