|
摘 要：目的 探讨DNA条形码技术在民族药紫丹参及其近缘物种鉴定中的应用，为紫丹参药材鉴定提供参考。方法 建立紫丹参及其混伪品DNA条形码参照数据库，通过比对序列、分析变异位点、计算遗传距离和构建邻接树等分析数据，并应用该数据库对市场药材进行鉴定。结果 DNA条形码技术可有效鉴别紫丹参及其混伪品。结论 ITS2序列可作为紫丹参及其混伪品的鉴定条形码，该技术在民族药物种基原鉴定、标准制定和市场监管等实际应用中具有重要的应用价值。 紫丹参，又名云南鼠尾草、滇丹参等，为唇形科植物云南鼠尾草Salvia yunnanensis C. H. Wright的干燥根，主产于云南、四川等地，为《云南省中药材标准》收载品种，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，用于月经不调、经闭痛经、癥瘕积聚、胸腹刺痛、热痹疼痛、疮疡肿痛、心烦不眠、肝脾肿大、心绞痛等症[1]。其在云南民间具有悠久的用药历史，始见于《滇南本草》记载“一味可抵 DNA条形码（DNA barcode）技术是当前生物学研究热点之一，已广泛用于中药材（不含矿物）的基原鉴定及其混伪品的鉴别，并取得了良好的效果学者采用DNA条形码技术对丹参、甘肃丹参和牛蒡的鉴别进行了研究，表明该技术可有效鉴别3类药材 1 仪器与材料 1.1 仪器 1-14K型高速冷冻离心机（Sigma公司）；6670型植物组织研磨仪（SPEX SamplePrep公司）；Biometra Tone PCR仪；DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；JY04S-3C型紫外凝胶成像分析仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；各种量程的微量移液器（Eppendorf公司）。 1.2 试剂 植物基因组提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，中国）；DL2000 DNA marker购自天根生化科技（北京）有限公司；三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇等购自北京化工厂，均为分析纯；引物由上海生工生物技术服务公司合成。 1.3 材料 éé 2 方法 2.1 DNA提取 2.2 PCR扩增及测序 ITS2序列扩增引物，以及PCR条件参照文献进行[16]，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。有条带的PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。 2.3 数据处理 夫模型的HMMer注释方法将所得序列及GenBank列。剪切好的序列提交到美国国家生物技术信息中心（NCBI，https://blast.ncbi.nlm./Blast.cgi）和中药材DNA条形码数据库（TCM Barcode，http://www./china）进行比对校验。采用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis）构建NJ（neighbor-joining）树，Kimura 2-Parameter（K2P）法计算遗传距离。 3 结果与分析 3.1 测序结果分析 27批植物样本包括4个鼠尾草属物种，其叶片DNA扩增和测序成功率均为100%；23批紫丹参药材中，有18批扩增成功，测序成功率为100%。经对未能成功扩增的5批药材进行分析，失败的原因可能是由于紫丹参药材主要为野生资源，多为民间少量采集，其干燥方式多样化，此5批药材在干燥过程中，可能采用了较高的温度进行烘烤，破坏了药材的DNA。而22批丹参药材其测序和扩增成功率均为100%，由于丹参为人工种植，其加工方式规范，亦从侧面证实了上述推测。 3.2 ITS2序列种内种间遗传距离分析 用于构建参照数据库的46条ITS2序列（27条植物样本序列，19条GenBank下载序列）长度范围为228～230 bp，GC含量为62.28%～68.85%。紫丹参种内13个样本间的遗传距离为0～0.018，与其他近缘种间的K2P距离为0.027～0.132。丹参种内7个样本间为0～0.009，与其他近缘种间的K2P距离为0.027～0.132。紫丹参及丹参的种内遗传距离均小于种间遗传距离，表明ITS2序列可用于紫丹参和丹参及其混伪品的鉴别。 3.3 聚类分析 基于46条含10个物种的ITS2序列，构建的NJ系统聚类树（图1）显示，10种鼠尾草属植物被分为4支，其中云南鼠尾草（紫丹参）和丹参、荔枝草3个物种各单独聚为一支，能与其他近缘种明显区分；其他7个物种甘西鼠尾草、荞麦地鼠尾草、毛地黄鼠尾草、橙色鼠尾草、栗色鼠尾草、三叶鼠尾草、戟叶鼠尾草聚为一枝，表明上述7个物种亲缘关系较近，采用ITS2序列无法对上述物种进行区分。通过NJ树可看出，ITS2条形码能有效鉴别紫丹参、丹参及其混伪品。 3.4 紫丹参药材鉴定能力分析 将45批经两位专家根据性状鉴定的药材（编号HMS-01～45），提取DNA后测序，将获得的ITS2序列分别在NCBI数据库（NCBI，https://blast.ncbi.nlm./Blast.cgi）和中药材DNA条形码鉴定系统（TCM-DBS，http://www./ china/）进行相似性搜索，DNA条形码比对结果见表3。从表3可看出，40批紫丹参和丹参药材DNA鉴定结果与专家性状鉴定结果一致。 将40批药材ITS2序列与上述46条参照样本ITS2序列构建构建NJ树（图2）。从图2可看出，紫丹参及丹参与参照植物样本各自聚为一支；其中样品HMS-02～12和HMS-16、HMS-17、HMS-19～23与紫丹参聚为一支；样品HSM24～45与丹参聚为一支，呈现明显的单系性。混伪品则各聚为一支，能够与紫丹参及丹参明显区分。因此，ITS2序列可作为紫丹参及其混伪品的鉴别，是紫丹参鉴定理想的DNA条形码。 3.5 紫丹参DNA条形码标准序列分析 参照《中国药典》2015年版DNA条形码指导原则，选取紫丹参药材和植物样本共30条序列，比对后长度为228 bp，有4个变异位点，分别为31位点A-T变异，38位点G-T变异，170位点T-C变异，204位点C-T变异。主导单倍型序列特征见图3。基于开源代码PHP QR Code的编码方式将紫丹参基原物种拉丁名和ITS2主导单倍型序列进行编码，获得紫丹参二维DNA条形码图片（图3）。将上述40批药材样品与紫丹参DNA条形码标准序列（YN1825MT27）比较计算遗传距离，可见以紫丹参种内最大遗传距离0.018为界限，可明显区分丹参与紫丹参药材，结果见图4。 4 讨论 4.1 ITS2可作为紫丹参及其混伪品的DNA条形码 DNA条形码鉴定技术为药材基原物种的鉴定提供了强有力的科技支撑[16]，其不受环境因素、样品形态和材料部位的限制，已成为中药原植物和药材品种鉴别的有效手段[17]。本研究将该方法用于民族药紫丹参及其混伪品的鉴定，结果显示紫丹参种内平均K2P遗传距离小于与近缘种的种间平均K2P遗传距离；此外，由构建的NJ树可以看出，紫丹参单独聚为一支，并与其他近缘种基原植物明显区分开。对40批药材的鉴定结果显示，DNA条形码结果与专家性状鉴定结果一致。因此，ITS2序列作可作为鉴别紫丹参基原植物及近缘种的DNA条形码。 4.2 DNA条形码标准序列对民族药鉴定的意义 正确的药材基原是保证药材质量和疗效的前提。药材的鉴定方法贯穿于种植、加工、生产等各个环节，传统的性状、显微和理化在中药材的物种鉴定上有一定的局限性[16]，难以满足医院、海关等各行业快速、标准的鉴定需求。《中国药典》2015年版已将DNA条形码ITS2及psbA-trnH序列作为候选序列收载[18-19]。本研究构建了紫丹参的标准DNA条形码系列，并将其用于40批药材的鉴别，结果显示鉴别效果良好。相比中药材，民族药多来源于民间贸易，且鉴别可参考资料有限，临床应用时不易区分，具有潜在的隐患。构建常用民族药材DNA条形码标准序列数据库，可以实现对常用民族药材的粉末以及细胞、组织等材料来源的准确快速鉴定和鉴别。本研究表明，DNA条形码技术在民族药物种基原鉴定、标准制定、药材流通等实际应用中具有重要的价值。 志谢：滇虹药业集团有限公司、拜耳医药保健有限公司提供资金支持；中国医学科学院药用植物研究所姚辉研究员对文章修改提出建议。 参考文献（略） 来 源：段宝忠，李 巍，邓海星，兰竹慧，吴中相，罗晓芳，Leslaw. Mleczko. 基于DNA条形码技术的民族药紫丹参及其近缘种鉴定研究 [J]. 中草药, 2019, 50(5):1204-1211. |
|
|
