免疫共沉淀(Co-IP)是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础,用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法。利用免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用,或者利用已知蛋白寻找与之相互作用的未知蛋白。相较于其他分子间相互作用检测方法(GST pull down等),免疫共沉淀实验的优势在于蛋白的结合在细胞内完成,能够反应天然状态下的蛋白质相互作用,结果更加真实可靠。 实验原理当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来,假如细胞内存在XY蛋白复合物,用X(X也称为诱饵蛋白)的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y(Y也称为靶蛋白)也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入X的抗体沉淀蛋白X,随后利用蛋白印迹(western blot,WB)检测沉淀中是否存在蛋白Y,如果存在,则说明细胞内存在XY蛋白复合物,即蛋白XY存在相互作用。 Co-IP实验流程免疫共沉淀实验流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE分离蛋白—WB检测是否存在靶蛋白。详细实验操作流程请至“免疫共沉淀实验操作流程及注意事项”查看。 收集蛋白样品蛋白样品通常通过裂解细胞得到。Co-IP实验通常有两种,一种为内源性蛋白相互作用验证,另外一种为非内源性蛋白相互作用验证,内源性相互作用是指两蛋白相互作用在细胞内发生,即通过质粒共转染的方式将两种蛋白转染至同一细胞内表达,表达完成后收集细胞进行裂解得到蛋白样品。非内源性相互作用两蛋白相互作用在细胞外发生,即将含有靶蛋白的动植物组织、器官进行预处理及细胞裂解获得细胞裂解液,随后将诱饵蛋白(通常为重组表达纯化获得)加入细胞裂解液中,得到蛋白样品。 沉淀诱饵蛋白利用磁珠偶联抗体沉淀诱饵蛋白:在样品中加入磁珠偶联抗体,抗体会与诱饵蛋白结合,利用磁铁将磁珠拉下,同时诱饵蛋白会一起被沉淀出来。如果存在与诱饵蛋白的相互作用的靶蛋白,也会被沉淀下来。如果没有诱饵蛋白的特异性抗体,可以给诱饵蛋白加上标签(Myc、HA、Flag等),然后利用标签抗体沉淀蛋白。 SDS-PAGE及WB检测得到沉淀后,需要验证沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE将蛋白复合物分离,随后利用WB检测是否存在靶蛋白(如果靶蛋白的分子量是已知的,可以直接用SDS-PAGE检测是否存在靶蛋白)。 实验对照设置为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用,而不是由于某些方面造成的人工相互作用(也就是“假阳性”),在Co-IP的实验设计过程中,需要设置正确的对照。
上述为了避免出现“假阳性”的对照称为阴性对照,除此之外Co-IP实验还会设置一个阳性对照组(Input组),Input组为直接利用抗体X(抗体Y)对细胞裂解液进行WB检测,验证细胞裂解液中存在蛋白X(抗体Y)。 免疫共沉淀结果真实性在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
免疫共沉淀技术应用免疫共沉淀实验可以用于:
随着对蛋白质研究的不断深入,人们将免疫沉淀方法与其他方法结合起来,在其基础上衍生出许多较为复杂的技术,从而使得分析方法更为多样化,它的应用范围也相当的广泛。免疫共沉淀是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术,可以应用于蛋白复合物的研究。它可验证蛋白复合物的存在,进而发现新的蛋白复合物;免疫共沉淀技术与免疫印迹法或质谱等方法结合,用于确定诱饵蛋白-目的蛋白在天然状态下的结合情况,确定特定蛋白质的新作用搭档。免疫共沉淀实验也可以应用于低丰度蛋白的富集和浓缩。 |
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