|
哈喽！大家好！欢迎来到小药频道 我们今天来看看CO-IP/IP免疫共沉淀的具体操作 免疫共沉淀（CO-Immunoprecipitation)和免疫沉淀(IP,Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。CO-IP和IP的实验过程很相似，CO-IP是对IP的具体应用，二者有一点差别。 IP:通过免疫沉淀，获得蛋白分子 CO-IP：通过免疫沉淀获得已知的蛋白及与之相互作用的蛋白。 实验原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A/G预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否具有相互作用。
简易版
图片来源于网络 下面先介绍一下实验流程及原理。建议IP或者CO-IP之前，熟练WB的技术流程和原理，这样就很容易理解其中的原理啦。 第一天： 1. 提蛋白：10cm的皿细胞长满，每皿根据细胞沉淀大小加IP裂解液（IP裂解液可以保持蛋白与蛋白之间的相互作用，内含蛋白酶抑制剂1:100，蛋白酶抑制剂保证蛋白不被蛋白酶分解）,涡旋30min（5min/次），离心13000rpm，4 C，30min。吸取上清为蛋白，尽量不吸取絮状物及沉淀。 2. 定量：Input组（留一部分蛋白直接做WB作为对照，排除非特异性干扰，证明总蛋白中含有目的蛋白），1mg蛋白（计算体积后用IP裂解液补充至500μl，裂解液包含蛋白酶抑制剂1:100），将定量好的蛋白样加入进口1.5EP（进口EP在旋转仪上旋转时不易弹开）中。 3. 磁珠清洗：取进口1.5EP，每个样品加20μl，加IP裂解液清洗（多少的磁珠用多少的裂解液），涡旋，放在磁力架上计时2min，用枪头弃液体，重复3次。（这一步可以在实验间隙提前进行）。 4. 去除与磁珠非特异性结合的蛋白：每个蛋白样品加20μl磁珠，涡旋，上封口膜，4 C旋转仪2h。 5. 抗体X与蛋白X-Y结合：瞬离，在磁力架上1min后将液体转移到新的进口1.5EP中，加抗体IgG（作为对照组，排除非特异性结合蛋白的干扰）、目的抗体（抗体质量保持一致），涡旋后上封口膜，4 C旋转仪4h。 6. 形成磁珠-抗体X-蛋白X-蛋白Y复合物：磁珠清洗（重复步骤3），每个样品加20μl磁珠，手动晃匀（切忌涡旋，此时抗体抗原已结合涡旋会使其断裂），4 C旋转仪过夜。 第二天： 7．洗去非特异性结合的蛋白：瞬离，放磁力架上2min后弃液体，各样品加IP裂解液（含0.5% Tween 20）500μl，手动晃匀，放旋转仪上5min，瞬离，放磁力架上2min后弃液体，重复上述操作2次，加入第3次IP裂解液后用枪轻轻混匀重悬转移至新的进口1.5EP中（防止管壁上残留的未结合的蛋白对实验结果造成影响），再重复洗3次(共洗6次：IP裂解液清洗体积分别为500ul+500ul+500ul+200ul+200ul+200ul)。 8．煮蛋白：瞬离，放磁力架上2min后弃液体，再瞬离使磁珠存于管底部，各管加1ХLB（用1Х电泳液稀释）25μl，涡旋，常温孵育10min，瞬离，磁力架上转移样品于新的1.5EP管或PCR管中，金属浴或PCR仪95 C，15min。（此时抗原抗体复合物分解为proteinA,琼脂糖珠，蛋白X,蛋白Y) 接下来就可以按WB跑电泳，转膜，封闭，一抗，二抗，显影啦。如果蛋白X和蛋白Y之间有相互作用，那么在条带上蛋白X和蛋白Y出现在分子量对应的位置。 IP/CO-IP实验周期较长，步骤繁琐，因此需要多注意细节，下期接着分享一些实验注意事项。 |
|
|
