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Co-IP 和 WB 差不多，多少占点「玄学」。其实 Co-IP 也是有迹可循的，从实验设计、样本制备、抗体固定、样本孵育、洗涤/洗脱、检测，这 6 步入手，一定能带你打败 Co-IP。 但实验室里还是会有几个师弟师妹因 「co 不下蛋白」苦恼。组会导师终于看不下去了！在群里发了一个教学视频——解锁免疫共沉淀讲座。 那我们就来看看，赛默飞的线上讲座都包含哪些干货内容。文字凝练笔记 精彩视频回放的教学形式，一定可以解决你的实验问题。 ▼ 点击下方卡片立即看视频 ▼  如果你没有时间回看讲座，也没关系，我们帮你总结了讲座的精华，整理成了笔记！接着看下去吧～ 一、实验前期准备 & 思考必不可少 在实验前，做好以下问题的思考，可以让你的实验事半功倍。 ● IP、Co-IP、pull-down：都有什么区别？如何进行选择？ ● IP，Co-IP 实验的流程是固定的吗？是否可以调整？ ● input，output，pre-clear，阳性对照，阴性对照，「行话」如何理解？ ● 抗体提前选经过 IP 验证的抗体，减少假阳性概率。 ● 抗体结合蛋白 Protein A, Protein G, Protein A/G, Protein L，到底选哪种？ ● 基质，琼脂糖还是磁珠？ ● 孵育顺序与孵育条件：抗体，裂解液，beads，如何排列组合？会有怎样的影响？ ● 整个 Co-IP 系统，涉及到裂解液，结合液，洗涤液，洗脱液，这 4 种溶液要如何考量呢？ 以上问题的答案，均可以从赛默飞线上「解锁免疫共沉淀」讲座了解。点击下方图片，直播精华抢先了解～ 二、6 步带你解锁免疫共沉淀        左右滑动查看更多 在了解以上 6 步后，大家在具体操作时可能会遇到很多个性化问题，我们收集了常见实验问题以及经典回答。看看是否有你的 Co-IP 困扰？ 问题：做 CoIP 实验的时候，是必须选择平时所用的某特异的细胞，还是用工具细胞也可以？是动物组织样本还是细胞样本？ 回答：CoIP 实验的目的一般是验证两个蛋白在体内的真实结合情况，所以选择工具细胞系，特殊的细胞系，还是组织进行，还是需要根据真实实验目的来进行。一般来讲细胞系要比组织更好操作些，如果没有合适的细胞系，直接用动物组织也是不错的选择。此外，如果两个蛋白间相互作用较弱，很容易在样本制备过程中就破坏掉，这种情况下会推荐使用交联剂先固定住蛋白间的相互作用，以保证在后续 Co-IP 实验中被检测到。 问题：请问 IP 抗体与 IF 抗体有什么区别？想做 IP 实验，但是没有目的蛋白的 IP 抗体，查了所有的公司，只有 IF 或者 wb 抗体，那么可以用 IF 抗体代替吗？ 回答：标注 IP 的抗体一般是可以做免疫共沉淀的抗体，标注 IF 的抗体是用作免疫荧光实验的抗体。在您选择抗体进行 IP 实验时，一定要优选选择 IP 验证过的抗体，不能用 IF 抗体来替代。如果实在找不到 IP 抗体，用IF抗体会比 WB 抗体的成功率更高。还可考虑换成 pull-down 实验。 问题：我跑出来的 Co-IP，为什么 IgG 有很浓的条带？ 回答：在实际操作的过程中很难避免一些非特异性条带，要看条带的位置，如果条带位置正好是抗体轻重链，且该位置在 input 组没有，IP 组有，是有可能的。可以通过多次漂洗，使用磁珠代替琼脂糖等办法，看看是否可以改善现有问题。 问题：请问跑出来 IgG 泳道有和 IP 组一样目的条带大小的条带，且不是轻链重链的大小处，是什么原因呢？背景也很干净，没有杂带。 回答：通常 IgG 对照是不能特异性结合目标蛋白的，如果出现条带了，要考虑同型对照或者琼脂糖珠/磁珠本身对蛋白的非特异性结合。 问题：IP 后蛋白分子量变化了（和 input 不在同一水平线上）是什么原因呢？ 回答：IP 下来的样本中可能含有较高浓度的盐或者离子去垢剂或者是不同的 pH 值（这个取决于使用的洗涤剂），这些成分可能会干扰 WB 检测时蛋白在胶内的迁移速率，所以会出现 Input 和 IP 后蛋白分子量不一样的情况，如果想要改善，可以试着在 WB 跑胶前调整一下 buffer 的成分，如果不严重干扰实验结果，也可以不调整。 向上滑动查看更多  |
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