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五、 目前个人认为生物医学研究的瓶颈就是是否能制备高质量的适合多种用途的抗体。很多所谓的主流研究方法都要依赖抗体。例如Western blot,免疫荧光，流式分析，ELISA，IP，CoIP, ChIP。个人对抗体制备的原理和方法不是很清楚，但是实际过程中很多并不想说明书上说的那样，结果是否漂亮，只有用了才知道。Western blot应该是抗体的最基本功能，他的最后原理是抗体结合到膜上的抗原，然后通过二抗来显示其位置。免疫共沉淀的抗体就不一样了，他要保证能够将你的目标蛋白及其复合物牢固的结合并通过蛋白A或G将其沉下来。 举个简单的例子说明二者的不同，不知道是否正确，一男（抗体）与一女（抗原）热情的接吻，在床上（膜）可能很容易办到，上述过程类似WB，抗体的功能只是识别固定物（转膜）上的抗原，风平浪静。相反，一男（抗体）与一女（抗原）热情的接吻，在激流中就不容易办到，上述过程类似免疫沉淀，是动态环境下的识别，而且必须特异性的牢固结合，这种接吻要求是热吻，紧密结合，并且最终用一个钩子（免疫沉淀中叫蛋白A或G)将男的勾下来后，要保证男的还热吻者那个女的（即抗原）。因此要求这个男的（抗体）要紧紧的抱住那个女的（抗原）。可想而知激流中（免疫沉淀）对男的质量要求更高，一定要保证不与女的分手。如果男的还三心二意，可能抱的是其他的女人，这在免疫沉淀中就会产生非特异性条带。因此，免疫沉淀一定要设置对照IG抗体来沉淀，如果随便一个男的（对照IG）也能将某个女的抱下来，那这个女的就是“博爱”，不是真正需要的最爱（特异条带）。鉴于目前很多男的（抗体）质量不可靠或者不能满足，因此大量的文献喜欢采用标签蛋白（例如，HIS,HA,GFP，MYC等）作为“特异男”来勾引“女”的。 个人认为需要一个个试，看那个能够用于免疫沉淀，有的抗体是针对男的“嘴巴”来设计的，这种抗体当然能够容易将女的抱下来，相反有的是针对其他部位设计制备抗体的，功能也就不一样了。Co-Ip成功的关键主要有两个：1）男的质量。2）男女接吻时的环境（例如是否有其他干扰因素，沉淀的时间，温度，比例，旋转强度等） 不对指正。 六、 想说下免疫沉淀，免疫沉淀是用你的抗体富集目的抗原，然后用WESTERN显示，你的抗体是否结合抗原。由于是富集了目的抗原，WESTERN不容易做出来的，用免疫沉淀可能容易出结果，但是也容易出杂带。如果看两个分子是否相互作用，可以用免疫共沉淀。 染色质免疫沉淀（EMSA）主要用于研究转录因子的。实验技巧是为了实验目的服务的，撇开实验目的，单纯讨论实验技巧，似不可取。另外建议：发现很多战友发贴，不注明实验目的，这样讨论，可能最后发现所讨论的实验技术并不是为你的实验目的服务的。 七、 关于抗体的问题，我的看法是： 1. 对应WB而言，使用的抗体识别的抗原应该是线性化的抗原（SDS）的作用，因此它识别的不是蛋白在具有正常空间结构时的抗原决定簇，而是在蛋白一级结构上相临的几个AA组成的抗原决定簇。 2. 对应FACS而言，多数情况下，它识别的是具有正常高级结构的蛋白的抗原决定簇，这些抗原决定簇可能是由相邻近的AA组成的或者是由于蛋白折叠后原本在一级结构上相距比较远的几个AA组成的，因此WB和FACS的抗体有时能够通用，有时不能通用。 3. Co-IP的情况，我认为和FACS是相类似的。 4. ChIP的情况最为头痛，因为它涉及了一个crosslink的过程，这个可能造成一些抗原决定簇被封闭掉，而且在免疫共沉淀使用的buffer中含有一些变性剂，进一步影响了抗原抗体的结合，因此WB可以用的抗体并不一定能用于ChIP，按照现在的说法，如果不是被validated过的抗体，做ChIP可能需要对多个抗体进行优化评估灵敏性和特异性。 至于是固相杂交还是液像杂交我觉得到不是重点，事实上，和固态的蛋白芯片相比较，液态蛋白芯片（luminex）的效率更高，因为抗原抗体有更加充分的机会接触。 八、 我想说的是不管是co-IP还是ChIP,一定要有阴性control，也就是和一抗相同来源的normal IgG。因为珠子本身可以吸附一定的蛋白和DNA，包括一些抗原抗体的非特异性结合，所以很多时候阴性control和实验组时间是量的差别，而不是有或无的关系。 九、 建议： 1. 有一种免疫沉淀的方案是有“radioactivesupernatant”，我们一般做的是不用同位素的免疫沉淀方案的，看具体的实验目的了。 2. santa cruz的抗体写了可以做IP，但是出厂不检验，看你的运气了，要多摸索条件。 3. 你的抗原是在细胞膜上还是在细胞核上，可根据情况选择裂解液。 4. 免疫沉淀的结果最好同时有WESTERN对照，这样可以知道是否成功沉淀了特异性条带。免疫沉淀本身还有个阴性对照。 5. 实验注意低温，操作细心。 十、 再次有问请教这里的前辈，我把IP下来的蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后进行WESTERN BLOT 或者考马斯亮蓝染色，WESTERN BOT可以明显看到我用于沉淀的蛋白，灰度几乎和抗体的重链差不多，可是考染的结果却只能看到重链和轻连，银染也是这样子，这可怎么办呢？我的目的就是要比较沉下来的东西有什么差别。沉下来的东西直接进行质谱鉴定应该怎么处理呢？如果你的蛋白和IgG的分子量差不多，则需要制作标签融合蛋白，以方便洗脱IgG和beads。 具体如下： 1. 制作含标签（如myc）的目的蛋白克隆载体。 2. 用含anti-myc的beads，pull-down目的蛋白。 3. 最后洗的时候，要有一次用myc的peptide洗脱液进行洗脱beads和anti-myc。 4. 这时上清就只含有你的目的蛋白，而去除了IgG. |
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