IP专题 | 从实验原理到疑难解析，一文带你上手IP实验！

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）我们已经出过几期内容，按照事物发展的总趋势——新事物终将代替旧事物，也是时候将内容更新一番啦。

重量级的先出场——来自Proteintech的技术团队出品的IP/CoIP实验技巧及问题解析讲座，从原理到操作面面俱到，涉及样本制备中裂解液的选择、对照的设置、抗体轻重链干扰的避免、没信号或高背景的原因分析等等内容。

视频预计观看时长40min，里面的内容我们也整理成文字版，我们将从原理，操作，配方，beads选择，抗体选择，常见问题，真实案例开始介绍，对哪部分感兴趣可以直接下滑至对应位置。

免疫沉淀原理

免疫沉淀是利用抗原抗体特异性反应，纯化富集某个特定目的蛋白的一种方法，以用于对该蛋白的后续研究。

基于抗体对抗原（靶蛋白）的特异性结合，通过偶联在琼脂糖上的亲和蛋白（如protein A sepharose beads）对抗体-抗原复合物进行亲和吸附，形成三联体，经洗涤去除未结合的杂蛋白，然后煮沸或酸性洗脱的方式使抗体、抗原一起脱落下来，得到的抗体抗原混合物经Western Blotting检测，最终依据显影后的胶片上是否有目的大小条带，来判断该抗体是否成功捕获沉淀了目的抗原。

免疫沉淀步骤

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样品裂解物制备

1. 培养细胞裂解物的制备

a. 收集细胞：细胞刮收集细胞于离心管中，4℃、500g离心5 min后弃上清；预冷1xPBS洗细胞2次，4℃、500g离心5min并弃上清。

b. 裂解：加入含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的预冷裂解液，重悬细胞，冰上裂解30min，每10min轻柔颠倒一次。

c. 超声破碎：冰浴超声破碎2sec、停2sec，总时长1-2min，功率180w。(注：若裂解物用于Co-IP实验，则此处避免超声)

d. 冰浴继续静置20min，进一步裂解。

e. 4℃、10000g离心20min，取上清测蛋白浓度，剩余按上清400μl/管分装于1.5ml的EP管中，冻存于-80℃冰箱。

2. 组织样裂解物的制备

解剖实验动物、取组织；液氮研磨或冰浴玻璃匀浆（较难研磨或耗时较长的组织，建议液氮研磨）。后续步骤与处理细胞时相似（超声破碎时间可稍长，但一般不超过5min）。

3. 蛋白浓度的测定

Bicinchoninic acid(BCA)法是近来广为应用的蛋白质定量方法。除此以外还有Bradford和Lowry法定量蛋白质。BCA 法的测定原理是蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，后者在碱性溶液中与BCA结合生成紫红色结合物，该复合物在562nm处有吸光值且与蛋白质浓度成正相关性，据此可测定蛋白质浓度。

Lowry法与BCA同属化学法，但BCA法灵敏度高，操作简单，形成的颜色复合物稳定性强，受干扰物质影响小。Bradford 属于染料结合法，易受到去垢剂影响。

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IP捕获

1. 酸洗脱法（可配合使用Proteintech免疫沉淀试剂盒，货号：PK10007；PK10008）

a. 根据实验需要，取-80℃相应的裂解物若干管，每管裂解物（约400μl，1-3mg总蛋白）加320μl孵育液（含蛋白酶抑制剂），转移至纯化柱。注：冰盒上操作；1 ml孵育液加10-15μl的PMSF（母液浓度100mM）和10-15 ul的Na3VO4（母液浓度100mM）。

b. 加入3-5μg一抗，IP阴性对照用同型对照的IgG，4℃旋转过夜。

c. 取一定量protein A或G（具体根据捕获抗体的亚型选择）sepharose beads（一般每个样约50-100μl），用1×PBS离心洗涤5次（500g离心30sec静置1min，最后加孵育液重悬beads至原体积）。通常来说，如果捕获抗体是兔抗体，小鼠IgG2a/IgG2b，则选择beads-protein A，如果是小鼠IgG1/IgG3，则选择beads-protein G。

d. 向步骤b中每管抗原-抗体混合物中，加入50μl洗涤好的beads-protein A或G，4℃旋转4h。

e. 现配洗涤液，每个样洗涤5次（自然滤干），待最后一次洗涤后，500g离心1min，弃尽残液，加堵帽封上。

f. 新取1.5ml EP管，编号，每管加10μl碱中和液和23μl 5 x Sample buffer，备用。

g. 每个柱中加入40μl洗脱液（pH2.0的酸性洗脱液），震荡混匀数秒，静置10min。

h. 去掉堵帽，将柱子按编号对应放入1.5ml EP管中，4℃，10000g离心1min，收集洗脱液。

i. 再次加入新的洗脱液，重复步骤g-h一次。

j. 沸水浴5min，直接用于SDS-PAGE上样或冻存在-20℃备用。

2.SDS sample buffer洗脱法

a. 根据实验需要，取-80℃相应的lysate若干管，每管裂解物（约400μl，1-3mg总蛋白）加320μl孵育液（含蛋白酶抑制剂P/V液）。

b. 加入3-5µg一抗，4℃旋转过夜。

c. 取一定量protein A或G sepharose beads（一般每个样50-100μl），用1xPBS离心洗涤5次（500g离心30sec静置 1min，最后加孵育液重悬beads至原体积）。

d. 向步骤b中每管抗原-抗体混合物中，加入50μl洗涤好的beads-protein A或G，4℃旋转4h。

e. 现配洗涤液，按5次/管进行洗涤（500g离心30sec，静置1 min），最后一次洗涤液约留50μl。

f. 每个EP管中加入50μl 2 x sample buffer震荡混匀数秒，100℃沸水浴5min。

g. 4℃，10000g离心1min，新取1.5ml EP管，将离心后上清按编号对应转移至1.5ml EP管中，直接用于SDS-PAGE上样或冻存在-20℃备用。

酸洗脱法：洗脱更温和，背景较干净。SDS sample buffer洗脱法：洗脱更彻底，信号会更强，但容易产生高背景。可根据实验需求进行选择。

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SDS-PAGE电泳

1.配胶

根据待分离的目的蛋白大小，选择合适浓度的分离胶，分离胶和浓缩胶分别灌注30-60min后即可凝固完全。

2.点样电泳

将经过IP制备的样品取出，同时与IgG对照、Input对照100℃煮沸5min，再恒压电泳约1.5-2h（具体时长与目的蛋白大小有关，浓缩胶一般80V，30min，进入分离胶后可调高至120-130 V，1-1.5h，以溴酚蓝带作为电泳指示）。

★ 转膜、封闭及后续部分请参考实验手册Western blot部分。

免疫沉淀常用试剂配方

免疫沉淀抗体选择技巧

免疫沉淀实验中需要用到捕获抗体（IP）、检测抗体以及二抗（WB），如何选择对很多小伙伴来说可能还有些难度。我们根据多年的实验经验总结了以下几点。

捕获抗体最好是挑选有文献报道或厂家验证过IP应用的产品更稳妥。为了减少或消除IP洗脱产物中抗体重轻链的影响，可以：

1）选择与捕获抗体不同种属的检测抗体，配合种属特异性二抗，能基本消除IP洗脱时的抗体重/轻链干扰，如下图；

2）捕获抗体与检测抗体为同一抗体时，可选择构象特异性二抗或专门抗重链（或轻链）的二抗；

3）检测抗体选择直接标记HRP的一抗；

4）捕获抗体共价偶联在beads（可减少IP产物中抗体重链）；

5）对于待捕获的靶蛋白为标签融合蛋白时，可以选择抗特定标签蛋白的纳米抗体。（纳米抗体结构不同于传统IgG抗体，不会产生IgG抗体重/轻链。Proteintech旗下Chromotek公司提供多种纳米抗体，详见官网。）

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免疫沉淀实验中二抗选择指南

免疫沉淀常见问题解析

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真实案例

近期我们进行了IP直播讲座，期间大家提供了很多的真实案例或疑难问题，我们挑选了18个具有代表性的问题进行了文字版解答，希望能给遇到类似问题的小伙伴一些帮助

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样品制备相关

Q1

裂解缓冲液如何选择？

理想的裂解液可以保留蛋白质的天然构象，将抗体结合位点变性减到最少，同时从样本中释放足够量的蛋白，以满足实验需求。

常规IP实验通常可用RIPA做裂解液；对于Co-IP实验，则建议优先尝试更温和的NP-40或TritonX-100裂解液（RIPA 裂解液可作为备选）。

Q2

裂解的时候不超声，可以涡旋吗？

常规IP裂解是可以超声、涡旋的。Co-IP为尽量减少对蛋白互作的破坏，尽量不超声，可用移液器吹打混匀（短时轻微涡旋亦可，不要太剧烈）。

Q3

只有protein A/G beads，没有加任何抗体，WB也可以检测到，怎么解决？

建议尝试以下方法：尝试lysate与beads做预吸附处理；减少正式IP实验中beads的用量并缩短孵育时间（如beads用量减半，孵育时间缩短至2小时）；增加洗涤次数和洗涤液严谨性。

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设置对照

Q4

IP或Co-IP需要内参吗？

一般不用，但需要设置Input对照和IgG同型对照。

Q5

lgG同型对照出现大小为110KD的带，是什么原因呢？

可能原因：1）非特异背景——可尝试lysate与beads做预吸附处理；减少正式IP实验中beads的用量并缩短孵育时间（如都减半）；优化洗涤条件，增加洗涤次数或时间。

2）在洗脱下来的IP样中补加适量新鲜的DTT，煮样后室温冷却后即用于电泳。

Q6

核蛋白的IP用弱的裂解液能裂开核吗？

可以

Q7

组织裂解的时候，可否用普通的冷冻破解机裂解？

如能保证裂解过程中样品的低温，那就可以。不过目前市面上已有最低温度达-40~-50℃的冷冻研磨机，对防止研磨过程中蛋白降解效果更好。

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抗原抗体孵育

Q8

孵育的抓捕抗体最少加多少呀？

一般不低于1μg，建议初步实验3-5μg。具体最佳用量与抗体亲和力及靶标丰度有关。

Q9

换了不同来源的同一个抗体下拉情况不一样是什么原因呢？

可能原因：亲和力不同；识别的表位有差异。

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亲和介质结合

Q10

抗体 裂解液先孵育和抗体 beads先孵育在结果上有什么不同？

有实验者做过，抗体 裂解液先孵育的方式，靶蛋白得率更高，业内采用这种方式也最常见。关于这一点，笔者虽未亲自对比验证过，不过后一种方法——抗体 beads先孵育，然后加入裂解物孵育，这种方式的缺点比较明显——加入裂解物后孵育时间若太短、则抗体不能充分的捕获靶蛋白，若时间过长、又容易beads与裂解物发生非特异性结合造成背景。

Q11

每次吸取含有beads的混悬液20ul，这样beads的含量是足够的吗？

20ul够做一个IP/Co-IP实验。

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其他方面问题

Q12

你好，用anti-flag磁珠IP胞内过表达的蛋白时，为什么会出现用anti-flag抗体检测不到信号的情況呢？

首先看Input对照是否有信号，如果Input也没有，那么可能表达不成功或者WB检测出了问题（抗体问题、稀释度不合适或ECL失效等）；如果Input对照有明显信号，而IP组没有信号，那么很可能是anti-flag磁珠的问题。

Q13

Co-IP实验中IgG抗体和目的抗体A的量要保证一样吗，自己实验中IgG也能拉下B，怎么解决lgG也能非特异拉下B呢

是的，同型对照抗体用量与IP实验组一样。解决非特异性的问题，可以考虑：lysate与beads做预吸附处理；减少正式IP实验中beads的用量并缩短孵育时间（如beads用量减半，孵育时间缩短至2小时）；增加洗涤次数和洗涤液严谨性；更换新的IgG对照抗体。

Q14

老师，如果靶蛋白在膜上或者一些不溶成分怎么办？

先正常裂解并IP/Co-IP测试，如果初步试验不理想，怀疑问题出在样品裂解环节，可尝试适当增加冰上裂解时间，增加裂解液中NP-40或Triton X-100的浓度（或换用含低浓度去垢剂的弱RIPA），以及瞬时超声。

Q15

老师，将抗体通过化学交联在protein A上做IP会影响结果吗？

理论上，会有一点影响，因为交联的方向不一定是定向交联（可能出现部分抗体是Fab段与protein A交联，从而可能影响这部分抗体Fab段捕获靶蛋白），实际可以通过适当增加交联的抗体投放量，减少它的影响。

Q16

IP捕获的产物，在WB电泳点样前是否需要测浓度呢？

不需要

Q17

抗体捕获beads怎么选择？

Beads-proteinA适合一般兔抗体和鼠单抗（IgG2a/2b），beads-proteinG则适合鼠单抗（IgG1/IgG3亚型）。

Q18

根据蛋白质分子量大小的不同，选择合适的实验条件？

1. 转膜时膜的选择

分子量大于等于20kDa的靶蛋白，选用0.45μm孔径的 PVDF膜；分子量小于20kDa的靶蛋白，选用0.2μm孔径的 PSQ膜。

2. 转膜电流大小

一般分子量大于100kDa可用200mA恒流转膜100min（按一个转膜槽计算），分子量小于100kDa宜减小电流，可用 160-180mA转膜90min。

以上就是IP的全部内容，祝大家实验一切顺利。