|
细胞养好了，蛋白抽好了，要开始“找朋友”啦。没错，每个细胞内部也是一个小小的世界，蛋白们也不是孤零的存在的，也需要与其他蛋白发生相互作用的而发挥功能。而最最常用的实验方法就是IP/Co-IP了。  常见IP/Co-IP实验步骤（熟悉的同学飘过） Step 1：固定抗体  Step 2：加样  Step 3：结合，去除非特异性蛋白  Step 4：靶蛋白（红色）洗脱或者互作蛋白复合物（红色+黄色）洗脱  Step 5：分析检测—Western Blot或者质谱  然后得到了这样的结果  上图证明了EDR1和EDR4有相互作用，想要获得如上漂亮的结果，在实验开始之前，让我们先对通常实验设计三要素：对照，重复，随机，进行充分了解和思考，这有助于获得solid的实验结果，减少实验弯路。 IP/Co-IP实验都有哪些常用对照呢？ ⅰ 阳性对照：证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白（IP）或者互作蛋白对（Co-IP，比如诱饵蛋白X和靶蛋白Y），即为常说的input。可直接使用细胞裂解物或者抽提好的蛋白溶液进行Western Blot。 ⅱ 阴性对照：用来排除假阳性。IP/Co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了，固然是值得高兴的，但是这结果是不是假阳性呢？还得做个阴性对照。以Co-IP为例，整个实验体系会出现beads，抗X抗体、诱饵蛋白X和靶蛋白Y：  注意：总蛋白上样量过多也会造成 非特异性结合，建议上样量为500ug-1mg。上样之前一定要先用BCA定个量！定个量！定个量！ ⅲ Output：在某些Co-IP实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行诱饵蛋白X和靶蛋白Y的WB检测，该对照组称为output组。 如何提高IP/Co-IP结果的重复性呢？ ⒈抗体的选择 ⒉结合蛋白 ⒊固相介质（基质） ⒋孵育（结合）顺序与孵育条件 ⒌缓冲液 抗体的选择 选经过IP验证的抗体，减少假阳性概率   结合蛋白 Protein A, Protein G, Protein A/G, Protein L? 先让我们了解他们的区别 a. Protein A—只与Fc区域结合 b. Protein G—结合Fc区域和部分轻链 c. Protein A/G—兼具Protein A和Protein G的结合位点 d. Protein L—只结合轻链 省事且通用可选择Protein A/G，也可根据结合力表格进行选择： 固相介质（基质） 琼脂糖还是磁珠？ 琼脂糖Agarose 特点 ● 1000g离心 ● 简单易用，直径大，结合力强 ● 多孔易吸附（记得做pre-clear：上样前先用裂解液过一遍柱子） ● 离心后取样容易造成取样误差（如下所示），可用带滤膜的空柱避免取样误差（Pierce IP/Co-IP试剂盒标配）
带滤膜的离心柱，下部有接样管，beads完全截留在滤膜上，避免上部取样造成的误差 磁珠 Magnetic beads特点 ● 直径小，动力学好 ● 操作简单 ● 表面光滑，beads吸附很少，背景低，抗体消耗少 ● 需配备磁力架 孵育（结合）顺序与孵育条件 抗体，裂解液，beads，如何排列组合？会有怎样的影响？ ● 抗体+裂解液，然后和加入beads ● Beads+抗体，然后加入裂解液 ● Beads+抗体+裂解液，三个一起上 从以上三个结果可以看到，第一种孵育方法抗原得率最高，第三种抗原得率最低。如果靶蛋白丰度较高，第一种和第二种差别并不显著。注意，整个体系选择同样的孵育顺序，以确保结果的重复性。 三组分的孵育温度和时间？ ● 固相介质为琼脂糖建议在4℃孵育4-6h或者过夜 ● 固相介质为磁珠，依据不同品牌的磁珠类型，建议孵育时间15min-2h 缓冲液 整个IP/Co-IP系统，涉及到结合液，洗涤液，洗脱液，这3种溶液要如何考量呢？ 结合液---利于蛋白之间的相互结合，要考虑孵育（结合）顺序 ● 如果抗体和beads先孵育，建议选择pH 8.2（更常用）或者pH5.0 ● 如果选用纯抗原作为诱饵蛋白X去拉裂解液中的靶蛋白Y，抗体和抗原的结合buffer选择中性PBS/TBS ● 如果诱饵蛋白X和靶蛋白Y来自细胞裂解液，那么裂解液配方建议选择非变性细胞裂解液，NaCl浓度＜150nM，SDS浓度＜0.2% 洗涤液---去除非特异结合蛋白，顾及互作蛋白间的结合强度优化配方 ● 如果互作蛋白作用较弱，建议选择PBS或者TBS进行洗涤 ● 通常会加入去垢剂降低背景，比如0.5-1% NP-40/TritonX-100/CHAPS ● 如果效果还不佳，还可增加盐离子浓度，比如＜250nM NaCl，以及加入1-2nM DTT/β-ME ● 还可增加洗涤次数，比如3-5次 洗脱液---将目的蛋白从固相介质上洗脱下来，依据捕获方式和下游应用优化配方 ● 如果诱饵蛋白或者靶蛋白带有标签，可用高浓度标签或配体进行竞争洗脱 ● 温和的配方：0.1M 甘氨酸（pH2.5-3） ● 也可使用SDS-PAGE上样缓冲液直接洗脱 下表是我们建议的对应不同洗脱环境的配方 实验前思考完结，开始实战 设计好实验，优化好条件，配好各种buffer和工作液，按照protocol，小心翼翼的丝毫不敢怠慢，Western后期待的结果却是：
这种情况要如何处理呢？除了更换一抗，还有其他选择么？如果IP或者Co-IP之后拉下的蛋白要做质谱鉴定，又有哪些注意事项值得提前做足功课？ 更多详情，请听下回分解。 |
|
|
