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免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一种纯化蛋白质的方法。将目的蛋白的抗体与样品提取液孵育，使抗体和蛋白质在溶液中结合。然后用protein A/G 耦合的琼脂糖凝胶，从样品中将抗体/抗原复合物提取出来。这种物理方法可将所需蛋白质从样品中分离，然后样品可以通过SDS-PAGE 进行分离并做 Western blot 分析。
收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或4℃裂解30 min， 12 000g离心30 min后取上清； 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1 μg 相应的抗体和10~50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； 免疫沉淀反应后，在4°C 以3 000 g 速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1 ml 裂解缓冲液洗3~4次；最后加入15 μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟； SDS-PAGE，Western blotting或进行质谱分析。 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。 通常用于免疫沉淀的抗体量非常大（1ug），所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而影响对目的蛋白的WB结果判断。如何避免重/轻链的干扰？分享两个小妙招： 1. 选择不同种属的抗体作为免疫沉淀实验和WB检测的一抗，再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB检测，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。 2. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物，最后离心去除抗体-agarose beads复合物，上清中只留下目的蛋白。 免疫沉淀实验用途非常广泛，基于最基本的免疫沉淀实验又衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段，如免疫共沉淀、染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀，它们之间的差异以及常见问题，小编会在后续文章中跟大家分享，爱我就请关注我~ 欢迎留言分享你的故事，实验也可以很动情 |
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