最后我想分享一个ChIP实验中的超声裂解问题，这可是影响整个实验流程的非常至关重要的一步！
超声超不好，实验白做liao
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这里，我们先来回顾下ChIP一般流程： 在这个过程中，涉及两个问题：一个是免疫沉淀的效率，即富集效率；一个是蛋白与DNA结合能力，即富集倍数。 超声破碎或酶切后断裂的染色质，一部分作为对照，不进行免疫沉淀；而另一部分进行免疫共沉淀，两者比较，得到的百分比即为富集效率。 富集倍数是指，实验中我们一般取两个抗体进行免疫沉淀，目的蛋白特异性抗体和阴性对照抗体（一般选和特异性抗体同种属的IgG），将两个抗体获得的 DNA 样品 PCR 后的 Ct 值进行比较，得到的比值即为富集倍数。 这里注意啊～～富集效率，富集倍数，都只是一个“相对的结果”，没有固定或特定的数值！有的实验会将相对于 IgG 阴性对照的5倍富集设为ChIP实验成功获得阳性结果的一个阈值。但具体实验具体分析，多查看文献，分析已发表的研究结果，而不要固守某一设定值。  这里再小小的补充一下下～～ 在 ChIP 实验中特异性富集目的蛋白结合的 DNA 片段，如果后续以 PCR 方法验证拉下来的 DNA 片段 ，才叫 ChIP-PCR；如果以芯片(chip) 的方式检测话，则叫 ChIP-chip，如果直接拿去测序就叫 ChIP-seq。 目前，较为常用的对拉下来的DNA片段进行鉴定的方法还是半定量 PCR 和 实时荧光定量 qPCR。其实有条件话，可以设计不止一对引物来反复验证 ChIP 实验的结果，这样才更具有说服力（比仅仅重复三次实验）。
那么好了，问题来了～如果转录因子结合的靶基因未知，我们又该怎么办呢？ 这种情况下，我们可以根据转录因子(蛋白)，运用生物信息学相关网站（后面我们也会陆续推送一些蛋白质相关数据库的运用）进行靶基因的预测，然后进行靶基因验证。如果未找到或验证成功互作的靶基因，可以进行质谱分析，看蛋白结合了哪些靶基因，然后再筛选感兴趣的靶基因，从而进行后续的探索研究。 这里再安利大家一篇文献《Chromatinimmunoprecipitation: a tool for studying histone acetylation and transcriptionfactor binding》，详细地阐述了ChIP这项技术的具体方法学及每个步骤中一些关键的点。毕竟这个实验做起来还是蛮长的一个protocol, 中间万一哪步做差了，都可能会影响到最后的一个分析结果，毕竟“失之毫厘，差之千里”啊～小伙伴们可要上点心啦～～ 最后我想分享一个ChIP实验中的超声裂解问题，这可是影响整个实验流程的非常至关重要的一步！ 超声超不好，实验白做liao 如果实验中间超声破碎后检测出来的各组样品异质性很大，就比如像下图这样的。。。很明显～～这四组样品超声后的结果完全不同质，这样的样品是绝对不能再进行后续实验步骤的了，不然也是浪费抗体啊！抗体可是很贵很稀缺的哦～～ 超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP 的效率。所以在超声波断裂染色质时，最好在冰水混合物上进行，且要设计时断时续的超声程序（这里本人一般是先准备几组完全相同的细胞样品，从20秒一次开始试，然后两次，三次依次递增下去…从而来摸索最佳的超声条件），注意一定要在低温下进行。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。 好了，今天就讲到这里，希望对大家有帮助。 |
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