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前面的文章中已经向大家介绍了免疫共沉淀技术（IP）的原理和方法，这一技术可以帮助我们便捷地探究蛋白与蛋白之间的互相作用。但若研究的靶蛋白可能发挥组蛋白修饰酶的功能，或是可能作为某种转录因子发挥作用，那么就要应用染色质免疫共沉淀技术（chromatin-immunoprecipitation，ChIP）方法来探究其与DNA的直接调控了。ChIP可以真实、完整地反映结合在DNA启动子区上的靶蛋白的调控信息，是目前基于全基因组水平研究DNA-蛋白质相互作用的标准实验技术。接下来，我们一起来学习一下ChIP技术吧！ 1 ChIP基本原理 ChIP是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测转录因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 基因的转录是从启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在基本启动子区起始转录，而这个过程通常需要一些特异的转录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平。此外，基因的转录还会受到表观遗传的调控，如组蛋白甲基化修饰、乙酰化修饰等，组蛋白特异位点的修饰均可以直接影响基因的转录水平。因此，ChIP主要用于研究特异的转录因子或组蛋白修饰酶与下游基因启动子区的结合，如果ChIP发现二者可以结合，那么这说明该基因可能是其下游基因。要想进一步证明，还要做高低表达和荧光素酶等实验。 目前，ChIP与一些高通量测序的结合，扩大了其应用范围：比如，ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-ChIP已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP-Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合，可分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 2 ChIP一般流程 目前广泛使用的ChIP实验试剂盒，通常需要2-3天的时间完成一次完整的实验，简易流程如下： 甲醛固定细胞→收集细胞，超声破碎或酶解法破碎细胞→加入目的蛋白的抗体，与超声后的靶蛋白-DNA复合物相互结合，过夜孵育； 加入Protein A Agarose，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联→纯化富集的DNA-片断→qPCR分析。在qPCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，使用qPCR更能定量地反映实验结果。 图1：ChIP流程图 3 ChIP前期准备 如果所探究的靶基因可能会发挥转录因子或是组蛋白修饰酶的功能，那就需要去筛选出其调控的下游目的基因，以该基因启动子区序列设计PCR引物，同时做ChIP进行验证。筛选目的基因的方法有以下几种：a，阅读文献，看转录因子和哪些基因在表达时间，空间，及功能相关。b，结合早期的实验结果，比如，你做高、低表达后，发现你的转录因子表大变化后，一些基因的表达也发生了变化，那么这些基因可以作为候选基因；c, 用一些分析工具进行初步的预测，这一部分的方法我们将在后续的推文中单独加以介绍。 ChIP检测的是转录因子与基因启动子区的结合情况，因此引物设计要选择目的基因启动子区，ChIP试验中启动子区一般选在转录起始位点上游1000bp的DNA片段（或者为了保险选择0~-2000bp），引物设计原则跟普通的引物相同，但是，超声后DNA被打断，所以PCR产物要尽量短一些，通常设计长度为200bp左右即可，因为产物长度越长，这段DNA被打断的可能性就越大，越不容易被扩增出来。因此，可以根据自己选择的片段，设计5~10段引物，在验证各引物的扩增效率之后，即可选择效果比较好的引物，用作后续ChIP的PCR验证。 ChIP实验需要涉及的对照组较多，在此加以总结如下： （1）Input组：样本经过超声，但是没有与抗体孵育，该组包扩了样本超声后的总DNA片段。Input组可以直接进行琼脂糖凝胶电泳，检测超声效果（一般超声后的DNA片段集中于300-500bp时，为较为理想的超声效果，过大或者过小都会影响后续结果）；同时，也可以与最后ChIP样本一起进行PCR验证，作为参照比较实验组的ChIP效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之则说明效率低，实验条件有待改进） （2）阳性对照组：一般用anti-RNA Polymerase II或H3抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因（当然是在该细胞中表达的基因，所以为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的）的核心启动子区，因此，理论上ChIP后PCR都会有条带。 （3）阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阳性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带，这组最理想的结果当然是没有条带，但是如果有一条淡淡的条带（与阳性对照和目的基因组相比），也是不妨碍的。 （4）实验组，这组即是用自己感兴趣的转录因子抗体，去检测感兴趣的基因片段。 |
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