3C、4C、5C、HI-C

       染色质构象捕获技术染色质构象捕获(3C)技术的要点是：福尔马林瞬时固定细胞核染色质，用过量的限制性内切酶酶切消化染色质 - 蛋白质交联物，在 DNA 浓度极低而连接酶浓度极高的条件下用连接酶连接消化物，蛋白酶 K 消化交联物以释放出结合的蛋白质，用推测可能有互作的目的片段的引物进行普通 PCR 和定量 PCR 来确定是否存在相互作用．3C 技术假定物理上互作的 DNA 片段连接频率最高，以基因座特异性 PCR 来检测基因组中 DNA 片段之间的物理接触，最终以 PCR 产物的丰度来确定是否存在相互作用。

      3C 技术适用于研究 5 kb 至数百 kb 染色质之间的相互作用．例如在酵母中，O'Sullivan 等[5]应用 3C 技术成功研究了两段相距 6 700 bp 的染色质间存在的相互作用．Skok 等[6]在人胸腺细胞中确定了相距约 600 kb 的两个染色质片段间存在相互作用．需要指出的是，单纯的 3C 实验检测到染色质间的相互作用不足以说明这些染色质接触具有功能意义．同样，使用 3C 技术没有检测到的染色质相互作用可能在真实状况下是存在相互作用的．若染色质间确实存在与蛋白质因子相互作用的片段，那么它们之间的酶连效率应比未发生定向作用的酶连片段高很多，因此，可以使用定量 PCR 的方法，对感兴趣的位点进行定量分析，找出活细胞中潜在的相互作用的染色质片段．3C 实验中使用的限制性内切酶最好是识别的序列长度为 4 碱基的内切酶，以保证在基因组范围基因组中存在大量的转录调控元件，对这些元件功能的研究还远远不够深入，这主要受制于现有的研究技术．利用 3C 技术有可能找出与不同转录因子作用的转录元件及其起直接作用的 DNA 区域内有较多的酶切位点(平均 256 bp 一个酶切位点)，这样可以增加空间上相邻片段的酶连效率。

       进行 3C 实验时，实验者必须知道所研究 DNA 片段和假定与其作用的 DNA 片段的部分信息，来设计 PCR 引物进行 PCR 实验进而确定这些片段之间是否存在相互作用，但这种假定本身就具有一定局限性，理论上做不到估计没有偏差．基于 3C 技术发展而来的 4C 技术可以弥补这一不足。

4C 技术称环状染色质构象捕获 (circular chromosome conformation capture) 或芯片染色质构象捕获 (chromosome conformation capture-on-chip) ．4C 技术的基本原理可概括为：福尔马林瞬时固定细胞核内的染色质，用过量的限制性内切酶将染色质 蛋白质交联物酶切消化，在 DNA 浓度极低、连接酶浓度极高的条件下将消化物用连接酶连接，蛋白酶 K 消化交联物以释放蛋白质(以上几步与 3C 相同)．此时，已知 DNA 片段(bait)与未知 DNA 片段

(通常位于基因调控区)已经酶连成环状，使用 bait 的特异 PCR 引物进行反向 PCR，若在福尔马林固定细胞时这些 DNA 片段间存在蛋白质因子介导的物理接触，此时应有 PCR 产物．对 PCR 产物进行序列分析可确定互作染色质的位置及互作的可能性。

若研究几百个染色质片段之间可能存在的相互作用，使用 3C 技术需要设计大量 PCR 引物来确定已知片段与假定片段的关系，通量较低，较难实现．因此，人们设计出 3C 碳拷贝(3C-carbon copy， 5C)技术，这个技术是基于 3C 的基本原理，结合连接介导的扩增 (ligation-mediated amplification， LMA)来增加 3C 检测的通量．以 3C 酶切连接文库为模板，在 3C 引物端加上通用接头(例如 T7、 T3)，例如在正向引物(bait)的 5′端加上 T7 接头，在反向引物的 3′端加上 T3 接头，若两个推测片段存在相互连接，由于连接酶介导的连接作用的性质，只有连接上的片段才有扩增．这样，利用通用引物 T7、T3 进行 PCR，而后将产物进行高通量测序即可实现高通量的 3C 实验．目前，已有专业的 5C 辅助网站帮助进行 5C 实验的引物设计。5C实际上是

多重3C需要设计大量的引物，无法真正进行全基因组筛选。

Hi-C 技术也是基于 3C 原理发展而来，主要步骤为：用福尔马林交联细胞内与蛋白质相互作用的染色体，限制性酶切进行消化，再将缺口进行补平(dCTP 进行生物素标记)，连接酶进行连接，将样本进行超声破碎，随后用生物素亲和层析将片段沉淀，加上接头进行深度测序，然后进行海量数据的拼接构建出相邻染色质三维空间结构图．进行 Hi-C 实验的难点不在于对染色质构象的捕捉，而在于怎样对海量数据进行分析处理[19]．染色质本身是聚合存在的，因此，所得数据存在很大的背景噪声，怎样消除背景噪声是Hi-C 技术应用的一大难点。

ChIP-loop 实验

在活细胞中，由蛋白质因子介导的单个 DNA 片段可能与多个位点相互作用，在不同的细胞中，同样的 DNA 片段也可能与不同的位点相互作用，这可能决定了不同细胞基因表达的时空差异． ChIP-loop 实验[15]是基于 3C 技术发展起来的、研究候选蛋白质因子介导的与目的 DNA 片段互作的一种方法，常用的有 ChIP-3C 和 ChIP-4C 技术[16]．实验流程上，只是在过量的限制性内切酶将染色质 蛋白质交连物酶切消化后，用所研究蛋白质因子特异性的抗体进行免疫沉淀，然后再进行酶切产物连接，后续步骤与相应的 3C 和 4C 步骤相同．应该注意的是，使用特异性抗体沉淀下来的蛋白质有可能作用于目的 DNA 旁边的位点，而不是介导目的 DNA 与其他 DNA 之间的相互作用．曾有文献报道通过封闭此蛋白质因子的表达来看目的 DNA 片段与其他 DNA 之间的作用是否真正存在。

ChIA-PET (chromatin immunoprecipitation using PET) 技术是 3C、paired-end-tags (PET)[18]和下一代测序技术的结合，既可检测细胞内染色质的相互作用又可解决实验所得 DNA 片段较小、数据量大等问题．它可以无偏的、在全基因组范围找出与目标蛋白因子作用的染色质片段．其部分实验流程与 ChIP-loop 实验相似，都是以福尔马林固定细胞，限制性酶切基因组，用目的蛋白特异性的抗体沉淀蛋白质 -DNA 复合物，给酶切片段加上带有生物素标记的接头(此接头带有特殊的酶切位点，例如MmeⅠ)，然后进行二次连接反应，再使用带有接头的酶进行酶切 (例如MmeⅠ)，所得产物再加上接头，进行深度测序[2]．使用 ChIA-PET 可确定目标蛋白与 DNA 作用的位点，也可进一步确定目标蛋白可能调控的基因 (图 1)．了解染色质空间折叠规律对于认识染色质结构、基因活性和细胞分化等方面都具有重要意义．对于细胞核内基因组的空间折叠，

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