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ChIP实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高，也较稳定，所以组蛋白研究起来更为容易，一般需要105-106个细胞即可完成一个ChIP反应。转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达，起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，建议使用超声断裂染色质的方法。因为酶法是化学处理，消化的位点往往比较均一，多是在核小体的连接处，酶消化有可能将核小体断裂的同时打断转录因子与DNA的结合。 2：ChIP实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制，可能会使蛋白变性，影响ChIP结果，有没有较好的优化方案？ ChIP实验中超声的优化一般从如下几个方面考虑 不建议重复已发表的剪切方案而不进行优化。当仪器不同于文献中所使用的仪器时，尤其如此。 目前有各种超声破碎仪器，水浴和基于探头的。在使用基于探头的超声破碎仪时，选择一个适用于您的样品体积的探头。 在任何情况下，剪切参数都应当根据您的样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。 优化应当包括功率设置（超声时间 vs. 间隙时间/休息时间）以及获得长度为200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数，每个优化实验只优化一种参数； 注意时间和功率设置。过度破碎和太高功率设置会损害在免疫沉淀步骤中的表位。降低ChIP信号。 始终保持裂解液冰冷，间断超声，而不是连续，因为超声处理产生热量会使染色质变性。 在超声破碎过程中避免气泡。泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。 在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。剪切不足所产生大的不溶蛋白质:DNA:RNA复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。 片段化的目的是确保高分子量染色质的蛋白质/DNA复合物是可溶的，能被ChIP抗体接近；为确保ChIP实验有良好精度，一般片段化的大小在200-1000bp，一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话，蛋白的结合位点很有可能被打断，原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp，加上不同核小体间的linker DNA序列，这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右，如果片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含目标序列的DNA，但所要研究的蛋白可能会离您目标序列有700个核苷酸的距离；如果过度片段化可能破坏抗原表位降低PCR效率，片段化不全导致样本丢失，可能会获得假阴性结果。 4：ChIP实验中最关键的一步就是ChIP级别抗体的选择，但是2011 年的一篇Nature文献报道中显示即使ChIP级别的抗体，结合特异性也只有70%左右，我如何选择高特异性的ChIP级别抗体？ ChIP实验中抗体的选择是实验成功的核心要素。在2011年Nat Struct Mol Biol [1,2]报道中通过斑点杂交和ChIP-chip试验显示，分别只有73%和78%的抗体具有较好特异性（图1，图2）。作者进一步通过WB检测3个品牌表观抗体的特异性，仅有一个品牌（Millipore）抗体通过特异性检测（图3），另外两品牌抗体未通过特异性结合实验。
针对这种情况给大家推荐一个非常好的方法，通过全球最大抗体查询网站CiteAb（http://www./）进行查询，能够获得每个ChIP抗体的文献引用次数（CiteAb显示Merck旗下多种表观遗传抗体全球使用率排名第一） Merck （含Millipore 和 Upstate 品牌）部分高文献引用的表观遗传学抗体 5：ChIP实验中需要选择ChIP级别抗体，没有ChIP级别抗体该怎么选择？如果我的实验种属比较特殊（果蝇，昆虫，植物等）该怎么选择ChIP实验抗体？ 但是由于ChIP级别（ChIP验证）过的抗体数量非常有限，所以当没有ChIP级别抗体时，我们有如下3种方法可以考虑： -选择IP/IHC/ICC进行尝试，一般在这些实验中抗体对蛋白的识别结构是native，和ChIP抗体识别结构较为相似；不建议尝试Western blot抗体，因为WB抗体识别的蛋白结构多是denature，并不适合ChIP实验； -将蛋白的序列放在NCBI上进行Blast，如果蛋白序列同源性与其他种属或物种蛋白超过80%，可以尝试跨物种抗体； -可以使用标签抗体，但是标签页可能干扰转录因子并可能引入假阳性相互作用，因此需要设置好对 6：免疫沉淀过程中琼脂糖珠和磁珠有什么区别，哪一种Beads的效果更好呢？ 在早期文献报道以琼脂糖珠为多，琼脂糖珠的优点是价格便宜，但是样本需离心，时间长，另外珠子在离心过程中可能破裂。琼脂糖珠存在非特异性结合，因此需要“预先清洗”染色质，除去可能与蛋白G琼脂糖非特异性结合的蛋白质或DNA。另外分层不明显，样品容易丢失。 当前主流的方法是以磁珠方法较多，磁珠的好处是样本无须离心, 操作时间短，另外磁珠表面光滑，背景低，因此无需封闭。磁珠还有一个好处是带颜色，分层清晰，样品不会丢失，但是磁珠需要需磁力架。因此在免疫沉淀是建议选择磁珠的方法。 琼脂糖珠和磁珠操作示意图 7：在免疫沉淀过程中Protein A和Protein G的beads的区别是什么，我该如何选择？我在免疫沉淀时抗体有时是兔源，有时是鼠源有没有通用的beads进行选择？ 蛋白 A微珠与兔多克隆抗体表现出最高的亲和力，而蛋白 G微珠与更广范围的抗体结合，包括大多数但并非全部种类的小鼠单克隆IgG。 当前还有一种Protein A/G 混合型磁珠，能够为免疫沉淀提供最大的灵活性，综合了蛋白 A和蛋白 G的结合特性，不用考虑不同种属IgG亲和力差异。此外，蛋白 A/G混合物通常比单独使用蛋白 A或G富集的倍数更高，产生的背景更低。因此在免疫沉淀时建议使用A/G混合型磁珠。 下图显示用A+G混合型磁珠能够显著提高免疫沉淀富集倍数 8：我在免疫沉淀的时候，我的样本、抗体和磁珠加样和反应顺序对实验结果有什么影响？有要求吗？ 一般有3种反应顺序： 染色质样本+抗体先反应，然后加磁珠； 抗体+磁珠先反应，然后加染色质抗体； 染色质样本+抗体+磁珠 三者同时反应。 无论选择哪种微珠，使用磁珠或琼脂糖珠的顺序可能影响您的ChIP信号。 第一种方法先将微珠与捕获抗体共同孵育（室温下几小时，或4°C过夜），接着加入染色质（样本），继续孵育（4°C震荡孵育1小时至过夜）。增加孵育时间有可能增加背景和ChIP信号；然而，与靶点亲和力低的抗体即使延长（过夜）孵育，也不产生明显的ChIP信号。 第二种方法将抗体与染色质样本先共同孵育，再加入微珠也能获得和第一种反应顺序相似的结果，均能较好的进行免疫沉淀反应。但是不建议同时加入这三个组分进行免疫沉淀反应，有实验验证显示同时加入三个组分虽然能减少开展整个反应所需的时间，但是和上述两种方法相比，结果较差。 9：ChIP实验中最关键的结果是什么？什么样的富集倍数被认为是阳性的结果？ ChIP实验本身其实就是一个通过免疫沉淀反应验证蛋白与DNA结合能力的实验。因此结果一般包括两个数据：免疫沉淀的效率（富集效率）, 蛋白与DNA 结合能力（富集倍数）。但是这两个结果本身都是一个相对值，因为富集效率就是断裂后的染色质分成两部分，一部分进行免疫沉淀，一部分作为对照不进行免疫沉淀，然后两者进行比较，得到一个百分比。富集倍数就是取两个抗体进行免疫沉淀，一个是特异性的抗体，另一个是阴性抗体（和特异性抗体同种属的lgG）验证抗体是否有非特异性的结合，然后将这两个抗体获得的DNA进行比较，得到一个比值。因此无论是富集效率还是富集倍数其实都只是一个相对的结果，没有特定的数值， 富集倍数的高低往往取决于蛋白质靶点的丰度，相对于低丰度的靶点，高丰度靶点有可能产生高的富集。一些实验室将相对于IgG对照的5倍富集设为成功实验的最低阈值。不过，最好将结果与已发表的结果比较，而不是固守设定值。 10： ChIP实验中DNA的检测在什么情况下用PCR反应？什么情况下用测序？ 当检测已知蛋白结合的DNA序列的时候，可以使用PCR反应进行检测，PCR可以使用End point PCR和Q-PCR方法，在PCR的时候除了样本组外，还需要设置input 对照，阴性对照和空白对照。PCR扩增片段长度200-400bp最佳，模板DNA片段过长，结合位点的邻近DNA会出现一定程度的信号富集。 但是有些情况下，蛋白结合的DNA序列是未知的，这时我们需要使用ChIP结合测序（Seq）方法检测，ChIP-Seq一般包括3个步骤：ChIP反应，文库构建和测序。一般有两种方法操作，一种使用普通ChIP试剂盒，获得纯化的DNA，然后交个测序公司，由公司进行文库构建和测序。还有一种叫做ChIP-Seq试剂盒，这种试剂盒一般包括ChIP反应和文库构建，仅需将构建好的文库交给公司进行测序即可。 |
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