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IP与Co-IP的原理都是借助抗原-抗体之间的专一性作用，形成抗原-抗体复合物，以此为基础研究蛋白质的经典方法。从下面的流程图就能看出，Co-IP和IP的实验过程很类似，Co-IP是对IP的具体应用，二者还是有区别的。 Co-IP 是通过免疫沉淀获得已知的蛋白及其互相作用的蛋白，以确定这两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的方法。 (Co-IP流程，图片来自网络) 有了上面的铺垫，更方便推出今天的主角，Co-IP。 设想一下。 例如，我们要研究蛋白X和蛋白Y之间是否存在相互作用，可以使用蛋白X的特异性抗体Z去结合蛋白X，假如蛋白Y能够与蛋白X结合后相互作用，那么理论上蛋白X、Y和Z将形成一个X-Y-Z抗原抗体复合物。此时，我们再使用protein A-琼脂糖珠耦合抗体Z，离心后就能得到protein A-琼脂糖珠-X-Y-Z复合物，加入上样缓冲液之后再煮沸，可以将protein A-琼脂糖珠-X-Y-Z复合物分解为protein A、琼脂糖珠、蛋白X、蛋白Y、蛋白Z。然后再通过western blot电泳，可以在条带上显示出蛋白的应该存在的位置。如果蛋白X和蛋白Y能够相互作用，那么此时应该能在条带上蛋白X和蛋白Y正确的分子量位置找到它们的条带。 (prorein A是从金黄葡萄球菌细胞壁中分离的蛋白，能特异性的结合到抗体的Fc段上，最终它可以与抗原、抗体一起形成复合物，而不影响抗原和抗体间的特异性关系。) 大致原理如上所述，接下来是原理的分述。 既然是验证生理状态下蛋白的相互作用，那么一定是在非变性条件下裂解细胞，这样可以将完整细胞内存在的蛋白质间相互作用保留下来，而我们常常进行的Western Blot是在变性条件下研究蛋白的表达水平。 如何才能将温和地释放细胞内蛋白，尽可能保证它们的原始状态呢？ 注意三点即可，第一是温和地释放细胞内蛋白，第二是保证释放出的蛋白不被蛋白酶分解，第三是实验过程保持低温。 细胞裂解必须采用温和的裂解条件，而不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，一般多采用非离子变性剂如终浓度为NP-40、或者破膜剂TritonX-100。严禁使用高浓度的变性剂0.2％SDS或者含去氧胆酸钠的裂解液，因为它们都属于离子型去污剂，会使蛋白变性。如果找不到适合的商用裂解液，可以尝试自己配制。 保证被释放的蛋白不被各种蛋白酶裂解是非常重要的。常规Western Blot实验时，我们会加入蛋白酶和蛋白磷酸酶抑制剂。在Co-IP实验时，我们需要尽可能地在裂解液中增加蛋白酶抑制剂的种类，并且保证现用现配，例如PMSF在溶液中30分钟即开始变性失效。 蛋白酶抑制剂可包含PMSF、EDTA、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂。蛋白磷酸酶抑制剂可包含激活的Na3VO4和NaF。使用的蛋白酶抑制种类并不是一成不变的，假如你要研究磷酸酶活性，显然不能加入磷酸酶抑制剂。 值得指出的是每种细胞的裂解条件是不一样的，这需要在前期实验中充分摸索后敲定。 获得了这些细胞裂解物之后，接下来就是加入足量的抗体，4℃缓慢摇床过夜孵育，保证抗体与目标蛋白充分接触。将预处理过的protein A-琼脂糖珠加入到已经抗体孵育的细胞裂解液中再次4°C摇床孵育3h，保证抗体与protein A-琼脂糖珠耦联；免疫反应结束后，在4°C离心机作用下将整个复合物离心至管底，小心吸取上清液，这些管底的复合物用裂解缓冲液冲洗，最后加入SDS上样缓冲液煮沸，将复合物分解为单个的蛋白，即protein A、目标蛋白X和蛋白Y、目标蛋白X的抗体。然后常规Western Blot电泳即可。 如果蛋白X和蛋白Y能够相互作用，那么最终应该能在条带上按照蛋白X和蛋白Y正确的分子量位置找到它们的条带。 需要提前做的是，在最开始获取了细胞裂解物之后要留取一点样品，跑一下Western Blot，并使用蛋白A、蛋白B各自的特异性抗体确定抗体A和抗体B在条带上的位置。以此充分论证上述Co-IP实验结果。 |
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