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第一步：了解免疫沉淀是什么？我为什么要做免疫沉淀呢？ 免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗体特异性反应，从特定混合物（通常是细胞裂解液或表达上清）中纯化富集目的蛋白的一种方法。传统的IP实验是抗体与目的蛋白结合后，再与蛋白Protein A /G（结合抗体Fc片段）偶联的琼脂糖或磁珠孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，复合物经过洗涤、洗脱后用于后续下游实验。IP是许多蛋白质相关研究的重要步骤，用于研究蛋白质的存在、相对丰度、蛋白表达的上下调、蛋白至稳定性及相互作用等。  （传统IP原理图） 总结： IP的整个过程我需要用到的关键工具有： 一抗：选择能与我的样本发生反应，能做IP实验的一抗； Potein A，Potein G或Protein A /G：Potein A，Potein G及Protein A /G与不同来源及亚型的免疫球蛋白结合能力不一样，如何选择？请参考https://www./affinity-of-protein-a-protein-g-and-protein-ag/
第二步：发现竟然没有合适的一抗来满足我需要做的免疫沉淀？ 某些目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀，如抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，无法与目的蛋白相互作用或抗体选择不合适，所选抗体不能识别处于天然构象的蛋白等，可以采用一个表位标记蛋白后，再选择针对此表位的标签抗体来进行免疫沉淀。厂家会推出一些常见的标签抗体用于IP实验，涉及flag、HA、His、Myc等标签，以满足大多数客户的需求。 特别是琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体，能最大限度优化免疫沉淀实验，节省时间和成本。 1）原理：省去了Protein A/G与抗原-抗体复合物结合的步骤，且解决了Protein A/G和抗体结合能力弱的问题。偶联抗体直接和目标蛋白结合后，通过离心或使用磁力架，将目标蛋白从细胞裂解液中分离出来。高特异性单克隆标签抗体可实现高产量和高纯度，稳定、预封闭的填料及特异性抗体减少了免疫沉淀过程中的非特异性结合。  （琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体应用于IP） 第三步：免疫沉淀后WB (IP-WB)出现重链、轻链干扰，怎么办？ 在免疫沉淀实验后的WB验证环节中，当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时，通常会出现对应免疫沉淀一抗变性后产生的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰。如何避免干扰， 方法一：选择只和重链或轻链反应的二抗。如果目标蛋白分子量小于30KD，为了避免抗体轻链的干扰，选择重链特异性二抗；如果目标蛋白分子量大于30KD，为了避免抗体重链的干扰，选择轻链特异性二抗； 方法二：选择WB一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰； 方法三：选择HRP直接偶联的WB一抗，省去二抗的步骤。 免疫沉淀三步击破，你掌握了吗？ |
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