|
背景  要点 裂解翻转于低温，避免降解是根本。 抗体珠子需加足，抗体蛋白过夜孵。 蛋白丰度了于心，重链轻链已变性。 Protocol与datasheet，研读操作需仔细。 常见问题解析 01 免疫共沉淀（Co-IP）与免疫沉淀(IP)的区别  IP  Co-IP IP：通过对某蛋白质的富集，研究该蛋白的特性（如翻译后修饰）。 Co-IP: 通过对某蛋白质的富集，研究与其结合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白复合物等）。 ▶ 关键试剂选择：使用可以富集蛋白的抗体是Co-IP的前提，因此，适用于IP的抗体都可应用于Co-IP。 02 Co-IP与Gst pull-down的区别 Co-IP：利用抗原抗体反应的特异性； GST Pull down：一般指用一个带GST标签的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，最后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物。 03 免疫共沉淀中的input是指什么？阴性对照的意义是什么？ input是阳性对照。免疫共沉淀实验中，会直接取细胞裂解液进行WB，用于验证细胞裂解液中确实存在目的蛋白。阴性对照是用来排出污染的可能性， 当阴性对照（即lgG对照）没有出现阳性说明没有非特异性的蛋白，当对照出现阳性，说明抗体有非特异结合的可能。 04 免疫共沉淀中ProteinA/G琼脂糖珠有何作用？ ProteinA/G能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段，因此能和抗体结合，而抗体与目标蛋白结合，目标蛋白和相互作用的蛋白结合。 05 Co-IP实验中如何去除重链轻链的影响？ 1. 靶标蛋白与抗体重链（55kD)、轻链(25kD)分子量差别很大 ; 2. IP抗体：将IP抗体固定于磁珠上 ; 3. WB抗体：IP捕获抗体（如鼠源）与WB检测一抗（如兔源）选用不同种属来源的抗体（初级方案）； 4. 特殊二抗：传统二抗可识别变性的重轻链， 而 Protein A/G-HRP 二抗仅结合完整的IgG。 06 Co-IP实验两个抗体需要不同种源吗? 最好选择两个不同种源的抗体。选择同一种源的抗体的问题在于：在WB之前进行的蛋白变性这一步，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链间的二硫键破坏, 从而使抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD， 如果目的蛋白在55KD或25KD附近，则IP抗体的重链或轻链和目的蛋白会重叠在一起，无法分辨。 07 进行IP反应时，抗体、磁珠的加样和反应顺序会对最终结果有影响吗？ 一般有三种反应顺序： 1.样本+抗体先反应，然后加磁珠； 2.抗体+磁珠先反应，然后放入样本中； 3.样本+抗体+磁珠同时反应。 推荐使用第一种和第二种，差别不大。不推荐用第三种，第三种方式虽然可以减少反应时间，但有实验表明同时加入三个组分的方式会使最终的结果变差。  Trouble shooting 高背景 制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体 ▶ 制备样品后进行短暂超声处理（3次，每次5秒钟），然后离心纯化，取上清后进行后续试验 洗涤不彻底 ▶ 多次洗涤，并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度 非特异性蛋白吸附于珠子上 ▶ 进行Preclearing以排除非特异性吸附 抗体本身特异性不好 ▶ 选择合适的抗体，可以考虑单抗 使用了太多的抗体 ▶ 进行条件优化减少抗体 使用了过多的细胞或组织进行裂解 ▶ 减少样本量，我们推荐100-500μg细胞裂解物 抗原降解 ▶ 保证样品中加入了蛋白酶/磷酸酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品 WB步骤 ▶ 使用规范的WB,注意封闭、一二抗稀释的条件 无信号 目的蛋白在样本中表达量低或者不表达 ▶ 首先对目的蛋白表达量进行检测，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并进行预处理。 ▶ 胞内蛋白互作的水平较低或没有互作，增加蛋白裂解物或进行诱导处理。 细胞裂解液使用不当 ▶ 根据实验需要选择，慎重考虑。 目的蛋白未被洗脱 ▶ 保证使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和pH值合适。 抗体没有很好的与珠子相互结合 ▶ 选择合适的珠子。 抗体选择不当或者不工作 ▶ 利用WB对抗体进行验证 抗体使用不足 ▶ 查阅文献或者说明书，并多次优化或选择合适的抗体使用量。 |
|
|
