IHC实验疑难解析大汇总

生物_医药_科研 2019-03-27

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本周小编将带来IHC系列培训的最后一讲，IHC实验中各种常见问题的原因分析和解决方案。希望通过本次课程，您可以了解到 IHC 实验中出现异常情况时您可采取的措施。

本节内容

切片无染色

高背景

非特异性染色

切片无染色

IHC 中可能遇到的一个主要问题是无染色。出现这一问题的原因主要有三个：

蛋白表达量低/无表达
样本制备不良
试剂/方案问题

1、表达量低/无表达

确定目标蛋白的表达量，用工具查询，Uniport官网: https://www./
了解目标蛋白表达的种属特异性和组织特异性，有时候目标蛋白在一些常见种属(如：人)有表达，并不表示在其他种属上也有表达。

解决方案：

在实验前查询文献，确定您待检测的目标种属和组织的表达量情况；
http://www./，在这个网站上会提供人体组织的不同蛋白RNA表达数据和IHC数据，可以作为参考；
在实验方案中添加阳性对照组织样本，验证实验体系的正确性；
阳性对照的细胞系，一些情况下，可以选择确定会表达目标蛋白的细胞系作为阳性对照；

质量优良的抗体说明书上会给出建议的阳性对照样本，可以作为参考。

图1、人体不同组织的表达分布，来源：proteinatlas官网

2、样本制备不良

固定步骤：过度固定组织或固定时间不够；固定时使用福尔马林和多聚甲醛固定剂可能会遮蔽抗体识别的表位。

解决方案：

用不同的抗原修复方法暴露表位（用 pH 6 或 pH 9 缓冲液热修复、酶修复等）。
如果过度固定，则需要缩短固定时间。

可能脱蜡不充分

解决方案：

延长脱蜡时间，且需要使用新鲜二甲苯。

图2 、不同修复液对染色效果的影响

3、试剂/方案问题

一抗问题：

浓度太低：按照说明书上的建议，梯度稀释抗体后实验，选择合适的浓度。
孵育时间不够：尝试在 4°C 孵育更长时间（例如过夜）。
抗体可能不适用于IHC应用，因为其可能无法识别蛋白质的天然（3D）构象。

检查抗体数据表，查看其是否在 IHC 中得到了验证及其 IHC 的类型（石蜡切片、冰冻切片等）。抗体在免疫细胞化学（ICC）或免疫沉淀（IP）中的成功使用暗示了抗体能够识别蛋白质的天然构象。

二抗问题：

使用的二抗为抗一抗宿主的抗体（例如，如果在兔中生产一抗，则使用抗兔二抗）。检查一抗的亚型是否被二抗识别。
用其他蛋白的一抗检测二抗效果，确保二抗正常使用。

高背景

免疫组化染色之后的高背景是困扰很多实验者的常见现象，如果您遇到类似问题，可以对照下表的分析，尝试相应的解决方案。

可能的问题原因	解决方案
没有封闭或封闭不足	增加封闭时间，考虑更换封闭剂。如果使用血清，Abcam 推荐使用二抗种属来源的正常血清（10%）封闭 1 小时。试用商业化封闭缓冲液。另一种选择是尝试预吸附二抗。
一抗浓度可能过高	滴定抗体至最佳浓度，进一步稀释抗体并在 4℃ 孵育（缓慢孵育，但有针对性地结合效果最佳）。
孵育温度可能过高	4°C 下孵育切片。
二抗可能是非特异性结合	使用不加一抗只加二抗的对照。如果您只看到二抗非特异性染色，请更换二抗，或者使用预吸附二抗。
组织冲洗不充分，仍残留固定剂	所有步骤之间用 PBS 充分冲洗。
内源性过氧化物酶具有活性	用酶抑制剂，使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制碱性磷酸酶，或用H₂O₂(0.3% v/v) 抑制过氧化物酶。
检测系统是荧光显微镜，固定过程引起自发荧光	福尔马林/PFA 通常在绿色光谱中出现自发荧光，因此可试用在红光谱内的荧光基团。如果您有红外检测系统，可以使用红外范围内的荧光基团。
信号扩增过多（间接技术）	减少扩增孵育时间，稀释二抗或扩增试剂盒试剂。
应用过多底物（酶检测）	更大倍数稀释底物，减少底物孵育时间。
色原与组织样本中PBS 反应（酶检测）	在与底物孵育前使用 Tris 缓冲液清洗切片。
通透破坏细胞膜并去除膜蛋白（膜蛋白）	更换通透剂（如用 Tween® 20 代替 Triton™ X-100）使用不含通透剂的缓冲液。