小鬼的转录组测序分析专题（三）

【转录组测序分析专题3】

SAM格式介绍

【转录组测序分析专题】将要讲解流程的内容如下：

往期精彩回顾

【转录组测序分析专题1】fq和fq格式介绍

【转录组测序分析专题2】gff和gtf格式介绍

此次介绍SAM文件，如有错误，还请各位大侠批评指正！

这两种文件格式本来应该放在进入分析内容里面讲得，想想还是放在前面与数据格式一起讲了算了。

在介绍之前，同样先抛出几个问题：

1，得到原始数据rawdata作了质控之后得到cleandata，然后与参考基因组比对，比对的结果会是什么形式的？

2，比对结果一般占很大空间，有没有一种格式可以将其转换为占空间较小的文件？

SAM格式介绍

SAM(The Sequence Alignment/Map format)格式，即序列比对文件格式，详细介绍见：http://samtools./hts-specs/SAMv1.pdf

SAM文件由两部分组成

头部区	主体区
1.以tab分列； 2.以’@’开始，体现了比对的一些总体信息。比如比对的SAM格式版本，比对的参考序列，比对使用的软件等。	1.以tab分列； 2.比对结果，每一个比对结果是一行，有11个主列和一个可选列。

1，头部区简要介绍

数据示例：

@HD	VN:1.0 SO:unsorted （排序类型）	VN是格式版本；SO表示比对排序的类型，有unknown（default），unsorted，queryname和coordinate几种。 我这个示例数据中没有这一行
@SQ	SN:contig1 LN:9401 （序列ID及长度）	每个参考序列为一行； 图片中展示的是人类参考基因组22对常染色体和一对性染色体以及每条染色体的长度
@RG	ID:sample01 （样品基本信息）	SM：样品名 LB：文库名 PL：测序平台 图片中样本为R01_N，测序平台为ILLUMINA
@PG	ID:bwa PN:bwa VN:0.7.10-r789 （比对所使用的软件及版本）	图片中使用的比对软件为bwa，CL是运行程序代码

2，主体部分介绍

主体部分有11个主列和1个可选列

数据示例：

每一列数据类型：

对于每一列内容的详细注解

第一列：QNAME

比对的序列名称 例如：E00528:55:HFHHKALXX:1:1101:12205:7480（一条测序reads的名称）（有没有发现这个地方用的名字就是fq文件中以@开头的那一行中的一部分？）

第二列：FLAG

 具体的flag值的解释，可以参考samtools软件提供的结果，samtools（Version: 1.3.1） 其中的samtools flags用法可提供flag值的查找结果

例如我要看FLAG 99是什么意思

0x63 只能由0x1，0x2，0x20和0x40组成，也就是这个read是双端测序；这个序列和参考序列完全匹配，没有插入缺失；这个序列对应的另一端序列比对到参考序列的负链上；代表这个序列是R1端序列， read1

第三列：RNAME

参考序列的编号，如果注释中对SQ-SN进行了定义，这里必须和其保持一致，另外对于没有mapping上的序列，这里是’*‘

第四列：POS

比对上的位置，从1开始计数，没有比对上为0

第五列：MAPQ

表示为mapping的质量值

第六列：CIGAR

CIGAR string，简要比对信息表达式（Compact Idiosyncratic Gapped Alignment Report），其以参考序列为基础，使用数字加字母表示比对结果，比如3S6M1P1I4M，前三个碱基被剪切去除了，然后6个比对上了，然后打开了一个缺口，有一个碱基插入，最后是4个比对上了，是按照顺序的，字母的含义如下：

第七列：RNEXT

下一个片段比对上的参考序列的编号，没有另外的片段，这里是‘*’，同一个片段，用‘=’

第八列：PNEXT

下一个片段比对上的位置，如果不可用，此处为0

第九列：TLEN

Template的长度，最左边得为正，最右边的为负，中间的不用定义正负，不分区段(single-segment)的比对上，或者不可用时，此处为0

第十列：SEQ

序列片段的序列信息，如果不存储此类信息，此处为’*‘，注意CIGAR中M/I/S/=/X对应数字的和要等于序列长度

第十一列：QUAL

序列的碱基质量值，与之前介绍fq是的碱基质量值是一个意思

可选列

可选字段（optional fields)，格式：TAG:TYPE:VALUE，其中TAG由两个大写字母组成，每个TAG代表一类信息，每一行一个TAG只能出现一次，TYPE表示TAG对应值的类型，可以是字符串、整数、字节、数组等。

敲黑板，重点实际举例！！！

我现在有一对双端序列Read r001/1和r001/2; r003是一个嵌合片段; r004 表示有gap的比对read。

然后用sam格式表示如下：

选一个第7行进行解释：

r001 147 ref 37 30 9M = 7 -39 CAGCGGCAT * NM:i:1

1. r001 比对的序列名称,

2. 147 FLAG值，利用samtools查看147的含义，0x93 147  PAIRED,PROPER_PAIR,REVERSE,READ2，表示双端序列，完 全匹配，反义链，双端序列中的read2

3. ref，参考序列的编号

4. 37 比对上的位置，根据图片中的coor可以看出为37

5. 30，表示为mapping的质量值，Q30为99.9%

6. CIGAR值，9M,表示9个碱基完全匹配

7. = ，RNEXT，=表示同一个片段

8. 7，下一个片段比对上的位置，第一行+r001/1比对到的位置

9. -39，Template的长度，最左边为正，最右边的为负，这个片段在右边，为负。

10. CAGCGGCAT，序列片段的序列信息

11. ‘*’，序列的碱基质量值，*为ascii码

12. ‘NM:i:1’，可选信息，不过还没明白是啥意思......

参考：

https:///wiki/tiki-index.php?page=SAM

http://boyun./bio/wp-content/uploads/2012/07/SAM1.pdf