Plus深读 | 53BP1核体加强了复制不完全的DNA的复制时间，以抑制可遗传的DNA损伤

DNA复制不完全是基因组加倍过程中的随机副作用，几乎存在于每个细胞周期中。有丝分裂时，复制不完全的DNA（UR-DNA）转化为DNA损伤，由子细胞遗传并隔离在53BP1核体 (53BP1-NBs)中。哥本哈根大学的学者们近日在Nature Cell biology上发表文章（https:///10.1038/s41556-019-0293-6），证明53BP1核体通过调整复制时间和修复路径，能使遗传性UR-DNA完成基因组复制，并防止随机的复制不完全现象转化为基因组不稳定因素。该研究阐释了新的遏制和修复基因组损伤的方式。

基因组复制的正确性是癌症倾向的决定性因素。DNA复制的精准性是通过专门的途径来维持的，如纠正核苷酸的错误融合，修复受损的DNA模板，消除复制分叉前进的障碍，恢复表观遗传记忆等。通过激活与延迟细胞周期偶联的休眠起点，可以在给定的S期促进复制完成。尽管如此，相当一部分UR-DNA从有丝分裂DNA合成（MiDAS）途径逃逸。DNA的后续溶解使得染色体得以隔离，但可能损害受影响基因座的完整性。这种DNA损伤由子细胞遗传，在53BP1核体中被隔离。

53BP1核体的形成与新生子细胞的细胞周期撤回之间存在关联。细胞周期检查点受损的细胞对53BP1核体形成的回应是在G1期出现短暂延迟，使得UR-DNA类损伤得以重新进入下一个S期。因此，一个悬而未决的重要问题是，在通过G2/S转换后，含有UR-DNA的细胞是否注定会发生基因组不稳定，或者它们是否有“第二次机会”完成易损基因座的复制，从而阻止染色体不稳定的扩增。而该研究表明，这样的第二次机会确实存在，该机会存在于53BP1核体固有的能力中，53BP1核体调节遗传的UR-DNA在基因座的复制时间。

该研究主要结果有：

1 53BP1核体的溶解与S期后期的DNA复制偶联。

尽管部分转化和非转化细胞在53BP1核体存在的情况下进入S期，但嵌入的UR-DNA的命运未知（图1a）。在能持续表达53BP1核体（红荧光蛋白标记）和PCNA（增殖细胞抗原）（绿荧光蛋白标记）的U2OS细胞系中，定量的基于图像的流式细胞术表明，53BP1和PCNA显示出与原始U2OS和未转化的hTERT-RPE1细胞中内源性蛋白质相似的动态；也就是说，在S期内，53BP1核体逐渐减少（图1b ）。这一结果验证了U2OS细胞系作为研究53BP1核体动力学的工具。为了确定53BP1核体的下调是否需要细胞周期进入S期，该研究通过抑制CDK4和CDK6（CDK4/6），实时成像发现在G1中滞留至少16小时的细胞有75%的53BP1核体滞留（图1c），即53BP1核体不能溶解在未退出G1期的细胞中，在G1中起作用的修复机制对其无效。低剂量复制抑制剂aphidicolin的预处理进一步增加了53BP1核体在G1停滞细胞中的滞留（图1c），支持了53BP1核体溶解和修复潜在的UR-DNA需要活性DNA复制的观点。

实时动态监测显示，PCNA最初在S期早期从53BP1核体中移除，随后从S期中期53BP1核体开始累积，在S期后期达到峰值，与它们的溶解一致（图1d）。内源性蛋白质的免疫染色证实了53BP1核体中的PCNA的移除和积累（图1e）。对70个53BP1核体的活细胞追踪发现53BP1核体和PCNA在90%以上的溶解事件中共存，表明53bp1-nbs在S器中期开始下降，随后在S期后期迅速溶解（图1f）。

为验证53BP1核体溶解与PCNA积累的关联是否对UR-DNA具有特异性，或者对53BP1核体病变的修复是否在S期有特异性。该研究通过电离辐射（0.5Gy）诱导并追踪到进入S期的细胞中由电离辐射诱导的53BP1焦点，发现与53BP1核体相比，80%的53BP1焦点的溶解在S期早期到中期，且没有持续的PCNA积累（图1g）。而且，即使在辐照过的细胞中，那些少量的溶解事件仍局限于S期晚期，且通常与PCNA的长期积累有关，即53BP1核体在清除所有53BP1焦点后滞留。溶解动力学和PCNA的参与清楚地区分了这两种53BP1修饰的损伤类型。总的来说，这些结果表明，53BP1核体的溶解协助了将逃过了2种修复机制（有丝分裂修复和细胞周期退出）的UR-DNA基因座恢复完整。此外，PCNA与溶解事件的偶联，表明与原址复制有关。

图1 53BP1核体的溶解与S期后期的DNA复制偶联

253BP1核体将UR-DNA的复制时间限制在S期晚期

基于上述结果，该研究假设，在第一个细胞周期中产生UR-DNA的DNA复制过程完全相同，使得下一个细胞周期中的问题得到解决，并提供第二次机会，最大限度地减少易发生复制不完全的基因组基因座的重复伤害。为验证53BP1核体在核体溶解中是否起到积极作用，需要通过独立于53BP1核体的、追踪遗传UR-DNA的蛋白质。目前没有这种蛋白质，但多个染色质结合因子在DNA损伤部位与53BP1核体共定位，其中一种蛋白质是RAD18，它在复制后的DNA修复中起作用，并以RNF8依赖的方式在染色质两侧的DNA损伤处聚集。因此，该研究假设RAD18与UR-DNA损伤有关，并且确实观察到它在53BP1核体处的积累。由于RAD18与受损染色质的结合独立于53BP1核体发生，这一发现揭示了通过RAD18追踪UR-DNA，从而直接测试53BP1核体在核体动力学中是否具有积极作用的可能性。该研究首先同时跟踪荧光标记的53BP1核体和RAD18，以验证RAD18作为UR-DNA的一个独立于53BP1核体的标记（图2a）。这两种蛋白在G1早期同时在核体中组装，并在S期中后期与染色质同步分离，除了一小部分RAD18即使在53BP1核体被置换后仍然存在，这可能表示在修复过程中RAD18与DNA结合（图2a）。

该研究对稳定表达荧光标记PCNA和RAD18的细胞中的RAD18-核体在53BP1核体存在和不存在的情况下，分别进行了活体细胞成像。RAD18-核体在53BP1存在时、在S期早期和中期排除了PCNA，这与进入S期后从头形成的RAD18基因座不同，并且与53BP1核体处PCNA积累的动力学一致（图2b）。然而，尽管53BP1的缺失对G1细胞中RAD18-核体的形成没有影响，但它加速了RAD18-核体处PCNA积累的开始至很早的S期（图2b，c）。上述数据表明53BP1确实在核体动力学中起到了积极作用，其机制是将UR-DNA的复制时间限制在S期晚期。

图2 53BP1核体将UR-DNA的复制时间限制在S期晚期

为了通过一种独立的方法验证53BP1核体对复制时间的调节，该研究去除了内源性53BP1，并用一个短干扰RNA（siRNA）抗性截短突变体（MFFR）代替它，该突变体能结合受损染色质，但较少有其它蛋白间交互作用（图3a）。与RAD18-核体的数据一致，活体细胞成像显示，在S期早期，PCNA在UR-DNA位点高度提早积累（图3b）。PCNA在MFFR核体附近的提早积累、以及两种蛋白质明显的共定位，仍分别与它们减少的平缓期和陡峭期相关。然而，完全溶解几乎总是失败，导致MFFR在S和G2晚期逐渐在受影响的基因座中重新积累（图3b）。与S期溶解的野生型53BP1修饰的核体相比，由MFFR补充的细胞在整个分裂间期保留了恒定数量的核体（图3c）。

3 RIF1强化了53BP1标记的UR-DNA的原址复制时间。

尽管53BP1在调节复制时间方面没有已知的作用，但它确实与已知的复制调节器交互。其中最突出的是RIF1，一种抑制DNA末端切除并定义哺乳动物基因组中后期复制区域的多功能蛋白。RIF1确实定位于后期复制的野生型53BP1核体，但不定位于其早期复制的MFFR对应物（图3d），这与最近发现的 该53BP1突变体不能针对其他类型的DNA损伤招募RIF1的结果一致。在没有功能性53BP1的细胞中，UR-DNA基因座的提早复制和失去RIF1招募能力是偶联的。RIF1的缺失重现了MFFR表型，其机制是通过诱导53BP1核体在S期早期内的提早复制（图3e，f）和损害53BP1核体在G2期中的溶解（图3e，f）。

图3 RIF1强化了53BP1标记的UR-DNA的原址复制时间

4 RAD52催化了遗传性UR-DNA的复制偶联修复。

53BP1和RIF1的协同作用将UR-DNA的溶解限制在细胞周期阶段，该阶段允许修复处理潜在的损伤。然而，53BP1和RIF1都没有直接执行这种修复的酶的潜力。结合53BP1和RIF1限制DNA末端切除的发现，该研究假设（在53BP1核体溶解过程中释放的）UR-DNA位点的切除可能会启动基于重组的间隙填充。通过定量分析53BP1与RAD51和RAD52（两种重组酶分别参与基因转换和重组依赖性DNA复制）的共定位发现，在非同步增殖的细胞中，RAD51很少与53BP1关联，BRCA2（重组DNA丝上RAD51的一种特异性载体）的缺失不影响53BP1核体的溶解（图4a）。即：RAD51催化的基因转化不会导致53BP1核体溶解，然而， RAD52与53BP1在核体部分的共定位显著增加，持续到S和G2期后期（图4a）。

为了解决RAD52和53BP1的共定位是否预示着正在进行的UR-DNA修复，作者们在实时细胞中追踪了共表达荧光标记的53BP1和RAD52，发现RAD52在溶解过程的晚期与53BP1核体短暂相关（图4b），推测此时53BP1的局部浓度不再保护DNA末端免于被过度加工（图4b）。与此一致，在整个G2期中53BP1被去除后，RAD52持续存在于受影响的基因座，在某些情况下甚至持续到分裂前期（图4b）。通过敲除Rad52发现，Rad52的缺失导致了53BP1核体的明显溶解缺陷，表明DNA损伤的持续性（图4c），因此，Rad52在执行第二次UR-DNA修复机会中起着关键作用。

图4 RAD52催化了遗传性UR-DNA的复制偶联修复

5 53BP1核体抑制UR-DNA位点的非计划重组。

RIF1或REV7的敲除并不影响RAD52与53BP1核体共定位的时间控制，表明RAD52介导的反应本质上局限于S和G2晚期。相反，RIF1或REV7的缺失显著增加了RAD51与53BP1核体的共定位（图4d）。53BP1下游效响应因子的抗切除分支的关键功能是阻遏RAD51与UR-DNA的结合，直至S期晚期。该研究提出，通过强制延迟复制、并抑制计划外的UR-DNA处理和RAD51的非法招募，53BP1下游效响应因子的互补功能为细胞在正确的时间和染色质背景下部署RAD52介导的修复反应、以解决潜在的损害，提供了第二次机会。

6 缺少53BP1核体会引发重组介导的染色体分离缺陷。

为分析RAD52介导的二次修复机会机制对基因组稳定性、以及对RAD51-非计划性参与的影响，该研究采用了一个新方法，分别在53BP1 缺失和存在的情况下，监测分裂后期姐妹染色单体交换（SCE）事件（图5a，b）。53BP1的缺失增加了第二个细胞周期中SCE阳性的分裂后期桥的出现。结果表明， 53BP1在抑制SCE中起作用，53BP1抑制不合法SCE事件的要求仅限于携带遗传性UR-DNA的子细胞。对UFB（超细分裂后期桥）的观察发现，在低剂量阿非迪霉素（aphidicolin）处理后的第一次有丝分裂中，BLM包埋UFB（另一种异常的DNA中间产物，可以从母细胞向子细胞传播）的频率增加，与53BP1无关（图5c，d）。然而，尽管对照组细胞的第二次有丝分裂中，UFB的频率恢复到背景水平，但在53BP1缺失的细胞中，UFB的频率仍然是升高的状态；重新表达53BP1可以恢复第二次有丝分裂中的UFB下调，而MFFR的重表达无法恢复UFB下调（图5e），证明53BP1为UR-DNA修复所必需。

图5 缺少53BP1核体会引发重组介导的染色体分离缺陷

作者们监测了FANCD2，急性复制不完全造成的RPA包埋 UFB的标记物；FANCD2阴性的UFB最近被鉴定为异常RAD51介导的、与致命染色体间融合相关的重组的产物。低剂量阿非迪霉素（aphidicolin）处理后的第一次有丝分裂中FANCD2阳性UFB增加，并且在细胞中以独立于53BP1的方式降低到第二次有丝分裂的背景水平（图6a）。然而，尽管FANCD2阴性UFB的频率在第一个细胞周期中不受急性复制应激的影响，53BP1缺失细胞的第二次有丝分裂中FANCD2阴性UFB的急剧积累（图6a）。由此得出，如果不进行UR-DNA的二次修复，会产生病理性重组中间产物，干扰染色体分离，威胁基因组的稳定性。

图6 未解决的UR-DNA会产生病理性重组中间产物

讨论

DNA复制不足和有丝分裂引起的基因组损伤的遗传性引起了人们的广泛关注，缺乏对细胞后续命运的了解阻碍了对内源性复制压力在癌症等疾病的发病机制中所起作用的认知。该研究提出一个假设模型（图6b），在UR-DNA逃过了修复、并转移至有增殖能力的子细胞的情况下，这些细胞仍然有最后一个机会，以避免在难以复制的基因座上的重复DNA损伤。而本研究证明这个第二次机会是由53BP1核体提供的，它在空间和时间上协调复制和修复事件。

该研究也提出了遗传性DNA损伤方面的两个此前未曾料到的问题。首先是，在UR-DNA损伤处组装53BP1核体的本质。UR-DNA不一定会转化为DNA双链断裂，但它会触发53BP1核体的组装，而53BP1核体严格依赖ATM激酶。染色质凝聚缺陷可激活ATM，而不伴随DNA断裂，这种凝聚缺陷也可能破坏或消除表观遗传记忆的重要方面。作者们推断53BP1核体的形成，以及它与RIF1结合以延迟发动的能力，可能是维持脆弱基因组区域局部复制时间的重要机制。其次是， RAD52介导的修复局限于S期晚期。这可能反映了修复底物的体系结构。RAD51介导的基因转换通常发生在分叉通过后，当姐妹染色单体作为供体时，UR-DNA损伤位于进入复制叉前的模板中，因此需要复制偶联修复。RAD52促进断裂诱导的复制，这是一种保守的DNA合成形式，该形式启动与驱动MiDAS（第一次修复）的断裂或被加工的复制叉处。这就增加了一种可能性，即修复在53BP1核体中隔离的UR-DNA可以利用类似MiDAS的因子。然而，尽管MiDAS与二次修复机制有重叠，但它们的基质、起始模式以及失败会导致的结果不同。最近，RAD52也被证明在RNA辅助的DNA双链断裂修复中起作用。尽管53BP1核体在转录中是沉默的，但常见复制不完全的基因座往往含有大基因，需要一个以上细胞周期才能完成转录，因而长寿的R环可能有助于UR-DNA修复。

小结

该研究揭示了53BP1核体如何抑制UR-DNA向基因组不稳定性的转化。该研究发现，53BP1和RIF1整合了对启动的控制和复制偶联DNA修复活动，从而复制不完全的危险位点提供了第二次恢复机会。通过协调这种二次修复机制，肿瘤抑制因子53BP1及其相互作用因子能够在通过有丝分裂后完成基因组复制。这些发现揭示了迄今为止人们尚未认识到的一种可能性，即全基因组复制可能需要一个以上的单细胞分裂周期。