Plus深读 | 真核生物DNA复制终止时Pif1家族解旋酶促进复制叉聚合

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https://www./molecular-cell/fulltext/S1097-2765(19)30060-7

近几十年来，真核生物DNA复制的起始和延伸阶段已被广泛研究^{1, 2}，但是DNA复制终止的研究相对较少。DNA复制终止发生在两个DNA复制体相遇时³，主要包括以下步骤：两个复制体的聚合和相遇，复制叉前导链和后随链之间间隙填补，复制体的去组装以及复制产物姐妹染色单体分离。我们对这些步骤的了解很少，其中对于复制叉聚合和复制体相遇的机制几乎是一无所知。在E. coli和SV40病毒中，II型拓扑异构酶介导复制链的解螺旋对于DNA复制中复制体的聚合至关重要^{4, 5}，然而真核生物中介导复制叉聚合的途径尚不清楚。在本文中，研究工作者对包含所有核心复制体组份以及I型和II型拓扑异构酶的重组酵母复制叉进行研究，发现大多数正在聚合的复制叉在非常晚的阶段出现停滞现象。进一步研究发现，Pif1和Rrm3 DNA解旋酶在这一阶段起着重要作用，即使在没有II型拓扑异构酶时下，它们也能促进复制叉高效聚合和完成DNA复制。此外，Rrm3和Pif1对于质粒DNA复制的终止也很重要。综上，本文研究工作者发现在真核生物中存在一种与原核生物不同的DNA复制终止途径，拓展了我们对真核生物DNA复制终止阶段的认识和理解, 为进一步研究真核生物DNA复制终止的调控机制奠定了基础。

一

实验结果

1 

在缺少辅助DNA解旋酶时聚合的复制体出现停滞现象

为确定重组的复制体能否在体外两个复制叉融合时完成质粒复制，研究工作者在含有结构特异性核酸内切酶Fen1和DNA连接酶Cdc9的反应中监测质粒复制新链的形成。如图1A，研究工作者使用3.2kb含有SbfI酶切位点的pBS/ARS1WTA质粒作为模板，体外反应中若完成质粒复制则形成3.2kb的新链（左侧），在碱性变性凝胶电泳中主要条带为3.2kb的DNA新链，而在非变形凝胶电泳中主要条带大小为3.2kb的线性DNA片段；若未完成质粒复制终止则形成晚期复制中间体LRIs（late replication intermediates，LRIs），在碱性变性凝胶电泳中主要条带分布小于3.2kb。如图1B和1C，变性凝胶电泳显示在Fen1和Cdc9存在时，反应产物可能主要富集在3.2kb；使用更精确的DNA marker（2900bp-3189bp）进一步分析反应产物，如图1D，产物大小位于3000bp至3100bp之间，提示重组复制体对质粒几乎所有DNA进行复制，但并未完全复制，可能在复制的终止阶段发生了停留。有趣的是，SbfI酶消化后的反应产物大小几乎是正常模板3.2kb的两倍（图1E），提示复制的质粒仍然通过短链与亲本质粒连接。研究工作者以9.7kb的pZN3质粒为模板进行脉冲追踪实验，并在反应中移除了Fen1和Cdc2以确保在变性凝胶中能监测前导链的合成，如图1F，大片段产物长度与产生的一半单位长度的先导链相一致。因此，LRIs是在DNA复制最后阶段亲本双链DNA解开前聚合复制体停滞产生的。

图1 在缺少辅助DNA解旋酶时聚合的复制体会出现停滞

2 

LRI形成并非由复制叉与MCM2-7相遇引起

为确定Mcm2-7复合体是否有助于LRI形成，研究工作者首先制造了上述3.2kb的“染色质化”的质粒。如图2A，裸露的DNA（lane 1和lane 3）不依赖于组蛋白伴侣蛋白FACT进行DNA复制，但是染色质上复制叉在缺少FACT的情况下产生弥散样的复制中间体（lane 2），而在FACT存在的情况下形成LRI与裸露DNA并无差异。这些数据提示通过染色质组装将Mcm2-7复合体限制在ARS1时，复制叉融合缺陷依然存在。接着，如图2B，研究工作者以ORC结合位点突变的质粒（pZN3和pVA18）进行体外DNA复制，使其复制起始从ARS306开始。如图2C，这三种质粒仍然形成LRIs，但并不能代表延伸缺陷，因为当以线性质粒为模板时，大多数产物长度与模板基本一致，即一个复制叉几乎完成质粒的整个长度的复制。最后，研究工作者以3.2kb的除ARS1外包含ORC结合位点的裸露质粒为模板研究Mcm2-7复合体在不同条件下的调控作用。如图2D，与40nM Mcm2-7复合体浓度相比，200nM的Mcm2-7复合体显著降低整个反应中产物比例，提示高浓度Mcm2-7复合体的确抑制DNA复制终止。然而，即使在低浓度（4nM）Mcm2-7复合体条件下，反应产物中超过80%仍然是LRI。因此，LRI的形成并非是由遭遇Mcm2-7复合体或者延伸缺陷引起的。

图2 单个DNA复制起始位点质粒上LRI的形成

3 

线性DNA可形成LRI

为进一步确定LRI能否在线性质粒复制体融合时形成，研究工作者以9.7 kb复制起点特异性的pZN3质粒为模板进行研究。如图3A，研究工作者在质粒复制时加入³²P-dCTP标记新生的DNA复制叉，在4 min时加入冷的dNTPs以及Smal，在靠近ARS306位点迅速切割质粒为线性质粒（图3B）。如图3C，与环形质粒相比（lane 7），线性质粒中全长比例增加约10%，但是在该条件下约80%产物仍然形成LRI。因此，即使两个复制体在线性化的DNA上相互接近时，大多数仍会在聚合时发生停滞。

图3 线性模板上LRI形成

4 

真核生物Pif1家族DNA解旋酶促进复制叉聚合

虽然在上述反应体系中两个复制体最终形成晚期复制中间体，但是在酵母提取物的反应体系下复制能够有效终止⁶，如图4A，线性质粒反应产物约90%是全长的dsDNA，这提示有效的复制叉聚合依赖于细胞内存在的其他因子但并不存在之前的反应体系中。LRIs的形成提示聚合的两个DNA复制体不能从亲本dsDNA上完成最后的分离，研究工作者推测这需要额外的DNA解旋酶促使DNA复制终止。如图4B，研究工作者表达和纯化了一系列的DNA解旋酶并将它们分别加入质粒复制反应体系中；如图4C，分别加入Pif1和Rrm3后，反应中LRI形成明显减少，全长质粒明显增加，提示它们对于DNA复制终止起着重要的调控作用。如图4D，Sgs1、Srs2和Chl1具有DNA解旋酶活性，而Dna2具有核酸酶活性。如图4E，细菌来源的Pif1并不能阻止LRI形成，即使增加酵母来源Pif1的10倍浓度亦是如此，但值得注意的是细菌来源的Pif1对40 bp DNA复制体解旋作用比酵母来源的Pif1更强（图4F）。因此，酵母中Pif1和Rrm3解旋酶特异性促进酵母复制体的聚合。

图4 出芽酵母菌Pif1和Rrm3 DNA解旋酶在体外促进复制叉聚合

接着，研究工作者构建了Pif1和Rrm3的突变体，如图5A，两者的突变体与其本身蛋白相对分子质量基本相同。如图5B，解螺旋实验揭示Pif1和Rrm3的突变体不能完成25 bp DNA复制体的解旋。如图5C，与Pif1突变体相比，Pif1能够促进预先形成的LRI完成DNA复制终止，且呈现一定的浓度依赖性；如图5D，Rrm3具有相似的作用。有意思的是，即使存在DNA聚合酶抑制剂aphidicolin时，Pif1也能对预先形成的LRI完成解旋（图5E）。值得注意的是，aphidicolin显著抑制DNA复制（图5F）。

因此，在DNA复制终止时，Pif1和Rrm3解旋酶通过解开亲本dsDNA促进复制叉聚合。

图5 Pif1-Rrm3解旋酶活性促进LRI解螺旋

5 

Pif1和Rrm3解旋酶通过不依赖于Top2的途径促进DNA复制终止

为确定Pif1家族DNA解螺旋酶促进DNA复制终止是否依赖于II型拓扑异构酶，研究工作者在存在Top1和/或Top2的情况下比较了Pif1驱动复制叉聚合的能力。如图6A，无论是否存在Top1和/或Top2，Pif1都能促进复制叉聚合，提示其促进DNA复制终止并不依赖于II型拓扑异构酶，但是在存在Top1和Top2的情况下，Pif1促进形成更多的全长DNA。接着，为进一步确定了Pif1和Rrm3是否能够完成DNA复制终止和形成产物，研究工作者在缺少II型拓扑异构酶的情况进行了DNA复制，如图6B，如果质粒复制完成，则在TopoIV作用下形成解螺旋的单体（左侧），如果没有完成复制则在溴化乙锭作用下形成负超螺旋的单体（右侧）。如图6C，Pif1和Rrm3的确能够形成解螺旋的单体；如图6D，在溴化乙锭存在的情况下，Pif1和Rrm3部分产物转化成负超螺旋的单体。因此，Pif1和Rrm3都能够在完全没有拓扑异构酶II活性的情况下驱动复制叉聚合和完成DNA复制。

图6 Pif1家族解旋酶不依赖于Top2完成DNA复制终止

06

Pif1和Rrm3解旋酶是体内质粒复制终止所必需的

为进一步确定Pif1家族是否为体内DNA复制终止所必需的，研究工作者在同步化酵母质粒复制时利用天然琼脂糖凝胶和Southern blotting筛选出现LRIs的酵母。如图7A和7B，在对照组中并未出现LRIs，而在rrm3D pif1-m2双突变的酵母中LRIs大量积累，然而LRIs在rrm3单突变或pif1单突变的酵母细胞中少了很多（补充材料图7A），提示Pif1和Rrm3在功能上具有重叠作用。为确定rrm3D pif1-m2双突变的酵母中LRIs的积累是由于复制叉聚合缺陷引起的而非复制叉屏障引起的复制叉停留，研究工作者进行了双向电泳。如图7C，与对照组相比，源自rrm3D pif1-m2双突变的酵母的包含一个LRI的酶切DNA在靠近顶部的X处形成巨大的双Y结构。因此，LRI是由质粒相对于原点的复制叉聚合缺陷引起的。

图7 Pif1-Rrm3是体内质粒DNA复制终止所必需的

二

小结

在本文中，研究工作者在酵母体外DNA复制过程中发现DNA复制晚期出现复制叉聚合停滞现象（称为LRI现象），进一步实验证明和揭示了Pif1家族解螺旋酶以不依赖于Top2的途径促进复制叉聚合以及DNA复制终止，拓展了我们对于真核生物DNA复制终止过程的认识和理解，为将来这方面的研究奠定了一定的基础。

参考文献

1. Bell, S.P. & Labib, K. Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 203, 1027-67 (2016).

2. Burgers, P.M.J. & Kunkel, T.A. Eukaryotic DNA Replication Fork. Annu Rev Biochem 86, 417-438 (2017).

3. Dewar, J.M. & Walter, J.C. Mechanisms of DNA replication termination. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 507-516 (2017).

4. Hiasa, H. & Marians, K.J. Two distinct modes of strand unlinking during theta-type DNA replication. J Biol Chem 271, 21529-35 (1996).

5.  Ishimi, Y., Sugasawa, K., Hanaoka, F., Eki, T. & Hurwitz, J. Topoisomerase II plays an essential role as a swivelase in the late stage of SV40 chromosome replication in vitro. J Biol Chem 267, 462-6 (1992).

6. On, K.F. et al. Prereplicative complexes assembled in vitro support origin-dependent and independent DNA replication. EMBO J 33, 605-20 (2014).