Plus深读 | lla在卵母细胞和合子发育过程中调控DNA甲基化的不同作用

Stella（也称为PGC7或Dppa3）被认为是原始生殖细胞（PGC）中高度表达的蛋白。在整个卵母细胞成熟过程中，Stella会维持其表达并持续进入到植入前胚胎。目前已经有研究表明了Stella广泛表达在胚胎发生和诱导多能干细胞（iPS）中。然而，Stella对卵母细胞发育的影响，特别是在细胞和分子水平上，仍然是未知状态。为此，来自南京医科大的Longsen Han等人通过CRISPR / Cas9系统构建产生Stella突变小鼠，用以研究Stella的功能。携带纯合突变的小鼠可以在敲除153-bp（StellaΔ）后仍然可以存活。作者通过western blot证实了突变小鼠中Stella的成功敲除。尽管排卵具有正常外观，但StellaΔ雌性在与突变体雄性杂交时是不育的。受精后，StellaΔ胚胎在植入前发育受损，很少达到胚泡期。这种截短的蛋白在细胞核中不存在，但仍然可以在StellaΔ受精卵的细胞质中通过免疫染色检测到。最近，Shin等人发现，母体Stella被泛素 - 蛋白酶体系统部分切割，N末端片段会保留在细胞质中，参与囊泡运输。因此，与先前报道的常规敲除小鼠相比，作者构建的突变小鼠模型可以加深对Stella功能的了解。

鉴于Stella调节受精卵中的表观遗传不对称性，作者研究了Stella是否也参与卵子发生过程中DNA甲基化的建立。为了解决这个问题，作者分离了来自StellaΔ和野生型（WT）小鼠的卵母细胞，然后使用亚硫酸氢盐测序（BS-Seq）方法对这些样本构建甲基化图谱（图1a）。作者发现，在WT卵母细胞中，全DNA甲基化水平为38％。然而，在StellaΔ卵母细胞中，平均甲基化水平显著增加至约68％（图1b-c）。在所有检测的基因组特征中观察到DNA甲基化的广泛升高，例如启动子，非翻译区（UTR），CpG岛（CGI），内含子，外显子以及主要重复元件（图1d-g）。这种模式表明StellaΔ卵母细胞的DNA甲基化变化会影响到整个基因组。为了更好地了解改变的甲基化情况，作者还搜索了WT和StellaΔ卵母细胞之间的差异甲基化区域（DMR）。总共识别出21,036个DMR，其中20,998个是高甲基化的（高DMRs; 99.8％），只有38个是低甲基化的（低DMRs; 0.2％）（图1h）。Stella通过结合UHRF19显示能够抑制DNA甲基转移酶DNMT1的募集，这可能是介导Stella对卵母细胞甲基化作用的关键途径。总之，作者的研究结果表明，Stella是一种新的必需因子，可防止卵母细胞发育过程中DNA甲基化过多。

图1：Stella在卵母细胞和合子发育过程中控制DNA甲基化的不同作用

为了追踪Stella对亲本基因组DNA甲基化的影响，作者分别分离了晚期受精卵的单个雌性和雄性原核用于全基因组分析（图1a）。在来自WT小鼠的卵母细胞和受精卵之间的母体DNA的甲基化水平中的变化有限。然而，在StellaΔ小鼠中，母体DNA甲基化组从卵母细胞（68％）到受精卵（55％）发生了显著的去甲基化（图1b-c）。作者发现StellaΔ受精卵的雌性原核中5hmC信号显著增加；而WT受精卵中的雌性原核表现出强度低得多的5hmC染色（图1i-j）。这些结果均表明在StellaΔ合子发育过程中母体基因组发生去甲基化。TET3是一种关键的双加氧酶，可催化父系基因组中5mC至5hmC的转化，而Stella可阻断TET3活性以维持母体DNA的甲基化水平。 StellaΔ受精卵中母体基因组的重度去甲基化可能是由于TET3获得了女性原核细胞。接下来，为了寻找哪些甲基化是被Stella保护的潜在基因座和基因，作者分别分析了来自WT和StellaΔ小鼠的卵母细胞和母体原核之间20kb窗口的DNA甲基化水平的差异。总共鉴定了6388个基因组基因座和2203个基因（图1k-l），例如发育相关基因Csmd1（图1m），Zdhhc6和Erbb4。GO分析进一步表明这些基因富含在神经系统和代谢过程中起重要作用的途径中。与WT受精卵相比，StellaΔ受精卵中父本基因组的平均甲基化水平显著增加，尽管程度并不显著（图1b-c）。作者的研究结果表明Stella参与了小鼠合子发育过程中母体基因组的DNA甲基化维持。

另一方面，作者注意到，尽管已发生DNA去甲基化，但与WT受精卵相比，StellaΔ受精卵中雌性原核的平均甲基化水平仍然升高（图1b-c）。这一观察结果促使作者提出StellaΔ受精卵中如此高水平的母体DNA甲基化可能起源于卵母细胞中的全基因组高甲基化。为了检测这种可能性，作者评估了不同基因组特征对StellaΔ卵母细胞和受精卵中DNA高甲基化的贡献。在StellaΔ卵母细胞的所有元件中检测到甲基化的增加，其中最大比例由基因间区域贡献（48％）。与其对应WT细胞相比，StellaΔ受精卵的母体基因组显示出相似的模式。WT或StellaΔ小鼠中卵母细胞和雌性原核之间不同元素的去甲基化程度几乎相同。当保护母体DNA免受受精卵中的去甲基化时，Stella对特定基因组区域没有偏好。此外，作者发现在StellaΔ受精卵的母体基因组中发现的91％具有高DMR（621/680）的基因确实是从它们的卵母细胞遗传的。总之，这些数据表明StellaΔ小鼠中卵母细胞甲基化组的全基因组高甲基化导致雌性原核中的DNA甲基化水平高于WT小鼠。考虑到BS-Seq检测的是5mC和5hmC的总和，并且在StellaΔ雌性前核中可检测到强的5hmC信号，在StellaΔ小鼠中从卵母细胞向受精卵转变期间可能发生更显著的DNA去甲基化。

总之，通过构建Stella突变小鼠模型，作者将Stella鉴定为在卵子发生过程中防止过量DNA甲基化所必需的新因子。受精后，Stella参与了合子发育过程中母体基因组甲基化的维持。作者还提供了来自StellaΔ小鼠的卵母细胞和受精卵中DNA甲基化景观的全基因组范围的综合图谱，其为表观遗传控制中的Stella功能提供了新的认知。