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反转录病毒载体感染法

 最后的大肠杆菌 2019-07-10

原核注射和ES细胞的基因打靶在小鼠上取得了巨大的成功,但是这些方法在其他物种上尚未获得明显成功,促使科学家寻找其他的替代方法。如,研究表明用反转录病毒特别是慢病毒载体可有效地将外源DNA导入卵母细胞。反转录病毒转导的雄性生殖系干细胞已成功产生转基因小鼠。

反转录病毒载体的基本结构:反转录病毒载体的两端有长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。LTR含有启动子和增强子序列,可以转录表达外源基因。在反转录病毒载体的5' LTR序列后,有病毒包装信号,去掉包装蛋白基因,留下的空间可用于克隆外源基因。反转录病毒载体克隆容量有限,插入的DNA片段需小于10kb。包装蛋白基因克隆入表达载体,制备包装细胞系。用反转录病毒表达载体转染包装细胞系或者与病毒包装载体共转染293T细胞制备病毒颗粒;然后用病毒上清感染胚胎细胞或ES细胞。由于透明带构成一个物理屏障,不能直接感染受精卵,可以将重组病毒上清注射到卵透明带与卵质膜间隙;或者先去掉透明带,然后感染无透明带的受精卵细胞;也可用显微注射操作系统,将病毒上清注入囊胚腔内,感染早期胚胎。将胚胎移入受体动物的输卵管,发育成转基因动物。病毒感染后,反转录病毒RNA基因组释放入宿丰细胞,在反转录酶的作用下,病毒RNA反转录为DNA,在病毒整合酶和其末端特异核酸序列作用下,随机整合到宿主细胞基因组中。

早期使用小鼠白血病反转录病毒(moloney murine leukemia virus,MMLV)感染制备转基因动物,后来发现MMLV介导的转基因,进入动物基因组后会发生基因表达沉默现象。最近发现慢病毒介导的转基因在动物体内更稳定。反转录病毒载体感染法转基因法操作简单,宿主范围广,不受胚胎发育阶段的影响,无导入基因的连环化现象,且单一位点单拷贝整合、整合效率高。该方法的不足之处是需要生产带有外源基因的反转录病毒;插入外源基因的长度有一定限制。反转录病毒整合只能发生在分裂期的细胞,而重组慢病毒可以用来感染未分裂的细胞。通过慢病毒载体感染的小鼠受精卵已制成许多转基因动物模型,如阿尔茨海默症转基因大鼠模型。

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