慢病毒稳转细胞系构建原理知多少？（收藏版）

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  // 2022 WINTER

目前用于转染的病毒载体包括γ逆转录病毒，慢病毒，腺病毒等，其中γ逆转录病毒和慢病毒属于逆转录病毒，能够将基因组RNA逆转录为DNA，并且整合到宿主基因组中，从而达到目的基因稳定表达的目的。慢病毒稳转细胞系的构建主要分为病毒包装和慢病毒感染细胞两个部分。

实验操作基本流程（以第三代慢病毒载体为准）

一、病毒包装

1.     构建四种质粒

包装质粒（携带gag基因和pol基因）

质粒（携带env或VSV-G基因）

质粒（携带rev基因）

载体质粒（携带LTR，ψ，RRE和包含内部启动子的目的基因）

2.     准备HEK293T细胞（工具细胞）

3.     通过瞬转方式（比如脂质运载体，磷酸钙沉淀法等）使四种质粒进入HEK293T细胞中

4.     在转染后48小时和72小时收集病毒上清液（可直接感染或浓缩后感染）

二、慢病毒感染细胞

1.     向细胞中加入病毒液

2.     抗生素筛选出稳定表达目的基因的细胞系

实验操作基本原理

一、 HIV病毒

HIV病毒包括RNA基因组和蛋白成分。基因组可以编码九种病毒蛋白；基因组两侧是长末端重复序列（Long Terminal Repeats, LTR），主要由U3（启动子），R（转录起始位点）和U5（逆转录相关位点）组成，是病毒逆转录，整合和转录所需的顺式作用元件；在LTR和蛋白翻译基因之间有“ψ”和RRE，“ψ”作为基因组二聚化和包装信号；RRE促进病毒基因组有效运输到细胞质中进行高效包装。HIV病毒进入宿主细胞中，通过逆转录酶将LTR之间的序列逆转录成双链DNA，然后通过整合酶将双链DNA整合到宿主基因组中。5’LTR倾向于将基因组整合到宿主基因组转录比较活跃的位点，3’LTR介导RNA 3’端多聚腺苷酸的形成，以稳定RNA序列。

二、 慢病毒载体

人为构建载体质粒，将LTR序列之间的病毒基因组替换成目的基因，利用HIV病毒的逆转录和整合功能将目的基因插入宿主基因组中。由于病毒基因组被替换掉，因此需要其他质粒来表达病毒实现逆转录，整合和转录等功能所需的功能蛋白，即包装质粒（携带gag基因和pol基因），质粒（携带env或VSV-G基因）和质粒（携带rev基因）；质粒所携带的基因功能如表1所示。其中env基因一般替换成VSV-G基因，主要是因为env蛋白只能与CD4受体结合，而VSV-G具有广泛亲嗜性，可以与多数细胞表面分子结合，扩大了慢病毒感染细胞类型，同时可以提高病毒颗粒的稳定性，尤其是高速离心过程中病毒颗粒的稳定。

1.      病毒包装

这一过程是在HEK293T细胞中实现的。

质粒进入细胞核中，在细胞核中完成转录，在细胞质中完成翻译，包装质粒（携带gag基因和pol基因）用于合成病毒的基质蛋白，衣壳蛋白和核衣壳蛋白等核心蛋白成分（gag基因编码蛋白）以及蛋白酶，逆转录酶和整合酶等（pol基因编码蛋白）；质粒（携带env或VSV-G基因）用于合成蛋白的外膜蛋白（env/vsv-g编码蛋白），用于病毒融合并进入细胞内；质粒（携带rev基因）用于合成rev蛋白；载体质粒（携带LTR，ψ，RRE，包含内部启动子的目的基因）用于转录出病毒的RNA基因组，包括LTR，ψ，RRE和目的基因的mRNA序列。RRE促进病毒基因组运输到细胞质中实现高效包装的；ψ为包装信号，引起病毒的包装；最终包装的病毒颗粒中有RNA基因组和功能蛋白（gag，pol，env/vsv-g，rev）。

此外第三代使用强异源启动子替代5’LTR的U3启动子，可以显著提高病毒RNA基因组的转录，从而增加病毒滴度。最终从上清液中获取包装好的病毒颗粒。虽然病毒包装这一步的完成暂且不需要整合功能，但病毒基因组难以避免的会整合到HEK293T细胞基因组中，因此完成病毒包装的HEK293T细胞会被丢弃。

2.      慢病毒感染细胞

使用病毒上清液（病毒颗粒）感染目的细胞，只有一次感染能力，而无复制能力，外膜蛋白协助病毒进入细胞中，同时完成病毒脱壳，病毒颗粒中的RNA基因组和蛋白成分分散在目的细胞质中。RNA基因组在细胞质中进行逆转录过程，生成双链DNA（前病毒DNA），由逆转录酶，整合酶，VPR，基质蛋白和前病毒DNA组成前整合复合物，穿过核孔（而γ逆转录病毒只能在核膜溶解的情况下进入细胞核中，因此只能感染分裂细胞），进入细胞核中。在整合酶的作用下，前整合DNA被整合到宿主基因组中，整合进去的目的基因的表达由内部的强异源启动子驱动，而非U3，因为U3属于弱启动子，需要tat激活才能放大效应，而我们构建的慢病毒载体中没有tat基因。此外，第三代使用SIN（自我灭活）替代3’LTR的U3结构，逆转录使SIN成为前病毒DNA（即整合到宿主基因组的载体序列） 5’LTR的启动子，从而丧失从此部位启动转录的活性。

3.      其他优化元件

cPPT：增加病毒基因组的核输入，提高载体序列整合到宿主基因组的效率

WPRE：增强病毒RNA在包装病毒的稳定性，增加病毒包装效率

辅助基因：在第二代慢病毒载体中被删除

4.      HEK293T作为工具细胞的原因

其一，HEK293T细胞中有SV40T抗原，可以增加载体质粒sv40 ori（复制）的活性，有效增加病毒滴度。

其二，HEK293细胞增值能力和转染效率高。