Hepatology：一种新的能量应激诱导的lncRNA MITA1可促进肝癌转移

生物_医药_科研 2019-04-03

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转移是癌症相关死亡的主要原因，但其潜在机制仍然存在知之甚少。长链非编码RNA (Long non-coding RNAs, lncRNA)是一类重要的恶性肿瘤调控因子；然而，它们在肿瘤转移中的作用仍未得到充分的研究。来自四川大学生物治疗协同创新中心的研究人员发表了题为“MITA1, a novel energy stress-inducible lncRNA, promoteshepatocellular carcinoma metastasis”的文章，

作者发现了一种新的lncRNA，称为代谢诱导肿瘤激活剂1 (MITA1)，它在肝细胞癌(HCC)中表达上调，并有助于转移。MITA1的诱导受LKB1-AMPK通路与DNA甲基化调控。沉默MITA1能显著抑制肝癌细胞在体外的迁移和侵袭以及肝癌在体内的转移。进一步研究发现，MITA1能通过促进Slug转录来促进上皮-间质转化(EMT)。MITA1缺乏会降低间充质细胞标志物的表达，尤其是Slug，而Slug过表达会显著削弱MITA1沉默对HCC的迁移和侵袭的抑制作用。在HCC组织中，MITA1和Slug前体的水平之间存在着正相关关系。本研究鉴定了一个新的AMPK-MITA1-Slug轴，为肝癌治疗提供潜在治疗策略。

1.一种新的能量应激诱导的lncRNAMITA1的鉴定

作者通过对有或无血清培养48h的PC3细胞核RNA进行高通量测序，生物信息学分析发现122 个lncRNA对血清饥饿有显著变化，其中44个上调，78个下调，作者注意到一个新的lncRNA，并命名为代谢诱导肿瘤激活剂1（MITA1），在血清饥饿后有5倍的上调，并通过qRT-PCR进行进一步验证，5’- and3’-RACE分析其全长11kb,Coding-Potential Assessment Tool (CPAT)确定其无编码蛋白的能力，PhyloP分析显示其在进化上高度保守，亚细胞组分分离显示其定位在细胞核。

2.能量胁迫通过LKB1-AMPK通路诱导MITA1表达

为了进一步验证MITA1与能量应激的关系，作者在多种肿瘤细胞有或无葡萄糖培养的情况下，qRT-PCR揭示葡萄糖饥饿法能诱导MITA1表达，而Hela 和A549细胞除外（LKB1缺失）。在Hela 和A549细胞中恢复LKB1表达，能恢复葡萄糖饥饿对MITA1的诱导表达。QRT-PCR分析表明葡糖糖饥饿能在肝癌细胞中显著诱导MITA1表达，而在补给葡糖糖12h 后，这种作用又消失。通过AMPK 激活剂或抑制剂处理细胞，能分别加强或减弱葡糖糖饥饿对MITA1的诱导作用。因此，结果表明能量胁迫至少部分地通过LKB1-AMPK通路诱导MITA1表达。

3.DNA甲基化参与能量应激诱导的MITA1表达

通过对MITA1基因组序列的分析，作者在第二个内含子发现了一个假定的CpG岛。作者近一部研究DNA甲基化是否在能量应激诱导的MITA1中起作用。亚硫酸氢盐转化率分析表明，在SMMC-7721细胞，葡萄糖饥饿显著增加MITA1的CpG岛内的DNA甲基化水平。用DNA甲基转移酶处理细胞，得到同样结果。鉴于活化的AMPK可以调节Dnmt3B的功能(19)，因此作者确定Dnmt3B是否通过能量应激诱导MITA1。沉默Dnmt3B使葡萄糖饥饿诱导MITA1表达明显减弱。此外，CHIP 析显示，葡萄糖饥饿导致DNMT3B与MITA1的第2内含子的相关性增加。综上所述，这些结果表明第2个内含子内的DNA甲基化参与了能量胁迫诱导的MITA1表达。

4.MITA1在体外促进HCC的迁移和侵袭

在SK-Hep1 和SMMC-7721细胞中沉默MITA1，划痕实验表明细胞的迁移能

力受到抑制，同时transwell 实验分析表明细胞的迁移和侵袭能力也降低。

5.MITA1 在体内促进肝癌的转移

MITA1沉默的稳定细胞系SK-Hep1通过尾静脉注射裸鼠，4周后取小鼠肺组

织观察，结果表明，沉默MITA1使肿瘤转移数减少，同时肺部组织转移灶降低。

6.MITA1通过EMT促进HCC转移

为了进一步研究MITA1促进HCC转移的机制，LC-MS用于分析MITA1沉默后的蛋白表达差异，922个蛋白表达差异明显，其中777个下调，145个上调。疾病相关性分析显示MITA1与肿瘤的致瘤性相关。KEGG信号通路分析显示紧密连接蛋白表达变化明显，并通过QRT-PCR 和WB 进一步验证，结果表明沉默MITA1后，间充质标记物N-CADHERIN，SLUG 和VIMENTIN表达下调，而紧密连接蛋白ZO-1表达上调。在小鼠实验中得到同样结果。

7.MITA1增加了Slug的转录

MITA1转录产物在染色质组分中富集，因此MITA1可能在转录水平调控基因的表达，QRT-PCR分析表明，MITA1沉默使间充质标记物分子表达下调，其中最明显的是Slug，同时通过回复实验，在MITA1沉默的肝癌细胞中过表达Slug，削弱了MITA1沉默对E-cadherin的诱导表达。因此，MITA1可能通过调控Slug的转录来调控EMT。