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免疫学检查是自身免疫性肝病诊断检查中很重要的一部分，检验科和临床医师都需要提高包括疾病表现和肝脏自身免疫血清学在内的专业知识。并非所有实验室都能开展全面的自身免疫性肝病相关血清学诊断检查，尤其对于诊断不明的患者，建议将其血清外送至质控实验室进行检测。  一、自身抗体 (一)自身免疫性肝炎(AIH) 1. 1型AIH.大多数AIH患者血清中存在一种或多种高滴度的自身抗体，但这些自身抗体大多缺乏疾病特异性。病程中抗体滴度可发生波动，但自身抗体滴度并不能可靠地反映疾病的严重程度。抗核抗体(antinuclear antibodies, ANA)、 抗平滑肌抗体(anti-smoothmuscle antibodies, ASMA)或抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(anti-soluble liver antigen/liverpancreas antigen,抗SLA/LP抗体)阳性者为1型AIH。 临床上，70%~80%的AIH患者呈ANA阳性，20%~30%呈ASMA阳性(国内报道阳性率多低于欧美国家)，ANA和(或) ASMA阳性者可达80%~ 90%。ANA和ASMA为非器官组织特异性自身抗体，在高滴度阳性时支持AIH诊断，低滴度阳性可见于各种肝病甚至正常人。 间接免疫荧光属于常规自身抗体检测方法，能够检测除了抗SLA/LP抗体外的所有自身抗体。该方法在大鼠的新鲜冰冻肾脏、肝脏及胃组织的合成基质上进行，可检测ANA、SMA和抗肝肾微粒体-1型(抗LKM-1)抗体。阳性血清应不断提高稀释滴度直至检测不出。间接免疫荧光法可见ANA在细胞或组织切片上的荧光模式(核型)以核均质型略多见，也常见多核点型、细颗粒型以及两种或多种模式混合型。目前尚未发现不同荧光模式在AIH中的临床意义。其他免疫学检查方法如ELISA或免疫印迹法也可以检测抗LKM-1抗体、抗肝肾微粒体-3型(抗LKM-3)抗体、抗肝细胞溶质抗原-1型(抗LC-1)抗体这些自身抗体，并且是抗SLA/LP抗体的唯一诊断实验。 (1) 抗核抗体: ANA是AIH患者血清中最先被发现的自身抗体，至今仍是诊断AIH敏感性最高的标志性抗体。它是细胞内所有核抗原成分的自身抗体的总称，其靶抗原包括细胞核、细胞质、细胞骨架和细胞分裂周期蛋白等。虽然ANA是1型AIH的血清学标志，但它不具有疾病特异性。在慢性病毒性肝炎、其他自身免疫性疾病甚至健康老年人群中亦可有阳性表现。用分子生物学方法提取部分ANA靶抗原，即抗可提取的核抗原(antiextractablemuclear antigens, ENA)。常规ENA谱包括:抗双链DNA抗体(dsDNA)、 抗干燥综合征抗原A抗体(SSA)、 抗干燥综合征抗原B抗体(SSB)、 抗核糖核蛋白抗体(nRNP)、抗组蛋白抗体(Histones)、 抗Jo-1 抗体、抗Sm抗体和抗硬皮病70抗体(Scl-70) 抗体等。上述抗体有助于对自身免疫性疾病进行诊断与鉴别诊断。 ANA的检测方法有多种，不同方法所报告的结果可能存在很大差异。AIH时ANA在Hep2细胞荧光模型中通常为均质型，但颗粒型也并不少见。该自身抗体在43%的1型AIH患者中呈阳性，并且和多种抗原特异性相关，包括组蛋白、双链DNA (15%)、 核染色质和核糖核蛋白复合物。然而，尚没有单独的自身抗体或者组合可特异性诊断AIH。因此，AIH的筛选阶段并不推荐使用Hep2细胞。 (2)抗平滑肌抗体: ASMA与多种细胞骨架成分(包括微丝、微管和中间丝)反应。ASMA的主要靶抗原是微丝中的肌动蛋白，后者又可分为G-肌动蛋白和F-肌动蛋白。高滴度抗F-肌动蛋白诊断AIH的特异度较高。研究显示，ASMA (1:80) 和抗肌动蛋白抗体(1 :40) 与1型AIH患者的血清生物化学指标和组织学疾病活动度有关，并预示治疗失败概率较高。 ASMA对包括F-肌动蛋白(F-actin)在内的多种细胞骨架分子产生反应，抗F-肌动蛋白自身抗体在AIH患者中约有41%的阳性率。诊断AIH时，ASMA/抗F-肌动蛋白抗体是适用的，可使用ELISA这一检测方法。但事实上，F-肌动蛋白并不是AIH特异性ASMA唯一的靶抗原，因此ELISA会漏诊20%的病例。 目前，ANA和ASMA检测推荐将间接免疫荧光法作为首选方法，检测结果推荐以滴度值表示。在我国，自身抗体检测主要有两种稀释体系，不同体系之间的结果不具有固定的对应关系。ANA和ASMA滴度越高，与自身免疫性疾病的相关性越大。临床高度疑似自身免疫性肝病的患者，建议进一步检测ANA中的特异性抗体( 如dsDNA、SSA/SSB、 gp210、sp100等)以帮助临床诊断和鉴别诊断。 (3)抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(抗SLA/LP抗体): SLA和LP分别在1987年和1983年被发现，起初认为是互不相同的，直到Wies从人肝组织中成功克降出SLA全长DNA序列并检测出2000例各种慢性肝病患者，发现SLA是肝细胞胞质的一种不知名的可溶性蛋白，与LP相同。如今将两者合称为抗SLA/LP抗体，是AIH的血清标志物。抗SLA/Lp抗体是唯一的疾病特异性抗体，因此有较高的诊断价值。国内外报道其特异性均接近100%，但检出率较低，我国多中心自身免疫性肝病回顾性调查结果显示，仅6% (16/248) 的患者呈抗SLA/LP抗体阳性，明显低于欧美常见报道(30%左右)。 抗SLA/LP抗体阳性者往往同时存在ANA。SLA/LP可能具有一定程度的致病性，有研究认为该抗体阳性与炎症较重、进展较快、易复发等特性有关。我国研究结果显示，AIH患者对SLA/LP抗原表位存在特异性T细胞免疫应答，并与肝细胞损伤的严重程度相关。因此，有学者建议将抗SLA/LP抗体阳性者归为3型AIH,但目前国际学术界尚有争议。 2.2型AIH .抗肝肾微粒体抗体-1型(LKM-1) 抗体和(或)抗肝细胞溶质抗原-1型(LC-1)抗体阳性者为2型AIH。 少数AIH患者(3%~ 4%)呈抗LKM-1 抗体和(或)抗LC-1抗体阳性，可诊断为2型AIH。抗LKM-1抗体阳性患者常呈ANA和ASMA阴性，因此抗LKM-1抗体的检测可避免漏诊AIH。抗LKM-1抗体的靶抗原为细胞色素P450 2D6 (CYP2D6)，已在AIH患者肝内检测到针对该自身抗原的CD4+和CD8+ T细胞的存在。LC-1所识别的靶抗原是亚氨甲基转移酶-环化脱氨酶。在10%的2型AIH患者中抗LC-1抗体是唯一可检测到的自身抗体，且抗LC-1抗体与AIH的疾病活动度和进展有关。 尽管有靶抗原的优势，但抗LMK-1抗体和抗LC-1抗体都不是疾病特异性的，因为该抗体在小比例(5%~ 10%)慢性HCV感染的成人和儿童患者中被报道。CYP2D6 和HCV蛋白之间存在同源序列是HCV患者抗LKM-1抗体阳性的基础，这些患者从基因角度通过分子模拟机制对AIH (主要DRB1*07阳性者)易感。已发现抗LKM-1抗体靶抗原和其他病毒蛋白的同源性。同样，因Wilson病行肝移植术的受体在排斥反应后可检测出抗LKM-1抗体。 此外，对常规自身抗体阴性仍疑诊AIH的患者，建议检测其他自身抗体，如非典型核周型抗中性粒细胞胞质抗体(atypical perinuclear anti-neurophilic cytoplasmic antibodies，pANCA)和抗去唾液酸糖蛋白受体抗体(antibodies against asialoglycoprotein receptor, ASGPR)等。pANCA在1型AIH中的阳性率为40%~ 96%，而在2型AIH中则几乎为阴性。有60%~92%的原发性硬化性胆管炎亦可检测出该抗体，而在原发性胆汁性胆管炎患者中仅为0~ 39%。此外，pANCA还可见于60%~ 87%的溃疡性结肠炎、5%~ 25%的克罗恩病和其他疾病。ASGPR是肝脏特异性的内吞受体，位于肝细胞膜上，是与AIH密切相关的肝特异性膜脂蛋自的组成成分。其疾病特异性较好，可见于各型AIH且很少存在于其他肝病或肝外自身免疫性疾病。该抗体的效价随AlH活动度变化。ASGPK阳性或高效价时提示疾病处于活动期，经治疗好转后抗体水平可下降甚至转阴，因而对观察疗效和评估病情有重要价值。 在AIH发生与发展过程中，自身抗体的滴度和特异性可发生改变，并且确诊时为血清阴性的个体在之后病程中也可表达常见的自身抗体。临床上可重复检测自身抗体以便更正疾病的诊断和分类。在成年人中，自身抗体滴度大致与疾病活动度、临床病程及治疗反应相关。除非临床表型显著改变，否则不需常规监测自身抗体。但儿童患者中，自身抗体的滴度是反映疾病活动度的有效指标，并且可用来监测治疗反应。尤其是抗LC-1抗体和疾病活动性有很好的相关性，疾病缓解时滴度可明显下降(>50%) 甚至消失，并且在复发时会骤然上升。 (二)原发性胆汁性胆管炎(PBC) 1.抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody, AMA)和抗线粒体2型抗体(AMA-M2) .高效价AMA，尤其是AMA-M2是诊断PBC的重要依据，其敏感性大于90%，特异性达98%。线粒体上有多种抗原成分，根据AMA的靶抗原在线粒体内膜或外膜上的位置及对胰蛋白酶的敏感性和电泳特征，将其分为9型(M1 ~ M9)。而PBC患者的AMA主要识别线粒体的M2抗原组分。M2抗原决定簇为线粒体上2-氧酸脱氢酶复合体的一些成分，包括丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)、支链二酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(BCOADC-E2)、 2-酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位(OGDC-E2)及二氢硫辛酰胺脱氢酶结合蛋白(E3BP), 其中PDC-E2是其最主要的自身抗原。虽然AMA在大部分PBC患者未出现临床表现、肝功能异常及肝组织学改变之前就可被检测到，但其效价和分型并不与PBC的严重程度及病情发展有关。5%~ 10%的PBC患者即使用目前最敏感的检测于段亦无法检出AMA (即AMA阴性PBC),但与阳性PBC患者相比，两者在临床表现、生化指标、组织学特征、预后及对熊去氧胆酸的治疗反应上均一致。尽管PBC中AMA的分型及阳性率与患者性别无关，但通常男性患者发现较晚，确诊时疾病多已处于进展期。 2.抗核抗体 .除AMA外，ANA同样是一个重要抗体，在PBC患者中的阳性率为50%，尤其当AMA阴性时可作为其诊断的一个重要指标。近来，越来越多学者认为ANA与PRC严重程度相关，可成为判断预后的指标。PBC中ANA的常见荧光模式为多核点型、核周型和抗着丝粒型。根据其靶抗原成分分别介绍如下。 (1)核点型ANA：靶抗原主要包括sp100、 早幼粒细胞性白血病抗原(promyelocytic leukemin, PML)及微小泛素相关的修饰因子(small ubiquitin-related modifer, SUMO)。sp100为可溶性酸性磷酸化核蛋白，相对分子质量为100 000。抗sp100 抗体在PBC患者中的阳性率约为30%，而在其他自身免疫性或风湿性疾病中的出现率仅为3%，因此是PBC的特异性抗体。但近来许多研究发现，抗sp100抗体在非PBC患者中的阳性率高于以往的报道，特别是在系统性红斑狼疮的患者中，故而对其在PBC诊断中的高特异性表示怀疑。但这些研究同时发现，抗sp100抗体阳性者发生肝硬化和高胆红素血症的可能要高于阴性者，且病情进展迅速。 PML蛋白为细胞转化和生长的抑制蛋白，异常表达于早幼粒细胞白血病细胞中。抗PML抗体最先在PBC患者中发现，也可见于其他自身免疫性疾病，但其阳性率明显低于PBC。同时本抗体在正常人群中为阴性。以免疫荧光法分析过度表达的PML细胞，发现抗PML抗体主要出现在抗sp100抗体阳性的患者中，两者具有相同的敏感性和特异性，阳性患者往往病情进展快，预后不佳。 SUMO是近来在PBC中发现的一种新抗原成分，它可共价结合sp100和PML。其中抗SUMO-1抗体和SUMO -2抗体可出现在抗核点型ANA抗体阳性的PBC患者中，两者的检出率分别为15%和42%，在阴性的PBC患者中则检测不出。 (2)核周型ANA：是PBC的一个特异性血清学标志，其靶抗原为核孔复合物和核膜。其中，核孔复合物主要包括gp210和p62。核孔膜糖蛋白(gp210) 参与核心复合体成分的黏附。抗gp210抗体对PBC的诊断具有高度特异性，虽然敏感性仪为10%~ 53%,但它和疾病活动性密切相关，阳性者较阴性的PBC患者其肝衰竭发生率明显增加。 p62是另外一种存在于核孔复合物中的糖蛋白，是PBC的一种自身抗原。抗p62抗体在PBC患者中阳性率为14%~ 32%，在干燥综合征患者中为13%，此外还可见于少数混合性结缔组织病的患者。研究提示抗p62抗体在PBC患者中的敏感性与特异性均高于其他自身免疫性疾病，且可能与晚期或进展型PBC有关。 少数PBC患者(约1%)可检出抗核内膜上核纤层蛋白B受体(lamin B receptor, LBR)抗体。抗LBR抗体对PBC亦具有特异性。 (3)抗着丝粒型ANA:在PBC患者中的靶抗原为着丝粒蛋白B (CENP- B),一种相对分子质量为80 000，与人类染色体着丝粒异染色质有关的蛋白。相关研究发现日本PBC患者除抗gp210抗体是肝衰竭的显著危险因素以外，抗着丝粒型ANA阳性者同样提示预后不佳，它与发生门静脉高压密切相关。 (三)原发性硬化性胆管炎(PSC) 约75%的PSC患者伴发炎症性肠病，最常发生的为溃疡性结肠炎，而克罗恩病则较少发生。非典型性核周型抗中性粒细胞胞质抗体(pANCA) 阳性支持本病的诊断，其识别的靶抗原主要为乳铁蛋白、组织蛋白酶G等。但由于其他慢性肝病，如PBC、AIH 患者中也可发现非典型性pANCA，因此仅为非特异性指标，对PSC尚无确诊意义。在PSC、AIH及溃疡性结肠炎中发现的非典型性pANCA特异性识别相对分子质量为50000的核膜蛋白，其阳性率达92%且仅存在丁中性粒细胞和其前体髓样细胞核膜上，故而将这种抗体称为核周型抗中性粒细胞核抗体(peripleral antineutrophil nuclea antibodies, pANNA)。但其效价水平与PSC临床表现、生化指标、疾病进程及疗效观察之间没有密切联系。相比较而言，肝脏纽织学检查及胆管逆行造影对PSC的确诊有较大帮助，其典型胆道造影为胆管壁不规则增生和弥漫分布的多位点狭窄。抗心磷脂抗体的效价可能与PSC的组织学变化及疾病严重程度有关。 二、血清免疫球蛋白 血清免疫球蛋白G和(或) γ球蛋白升高是AIH特征性的血清免疫学改变之一。血清IgG水平可反映肝内炎症活动程度，经免疫抑制治疗后逐渐恢复正常。因此，该项指标不仅有助于AIH的诊断，而且对检测治疗应答具有重要的参考价值，在初诊和治疗随访过程中应常规检测。由于血清IgG水平的正常范围较宽，部分(5%~ 10%)患者基础IgG水平较低，疾病活动时即使IgG水平有所升高，但仍处于正常范围内，而治疗后检测可见IgG水平明显下降。IgG4 是IgG的4个亚群之一，占正常人血清IgG的5%,其抗原亲和力差，也缺乏结合C1q补体的能力。血清IgG4大于正常值(≥1 350 mg/L)可作为IgG4-相关疾病(包括IgG4- SC)的血清学诊断标准之一，但在AIH中的价值尚未明确。AIH 患者血清IgM水平一般正常，血清IgA水平偶见升高。血清免疫球蛋白M升高是原发性胆汁性胆管炎的免疫学特征之一，可有2~ 5倍正常值上限的升高。但需指出，IgM升高也可见于其他自身免疫性或感染性疾病(图1-1)。 参考文献 1 Krawitt EL. Autoimmune hepatitis [J]. N Engl J Med, 2006, 354(1): 54-66. 2 Liberal R, Grant CR, Mieli-Vergani G, et al. Autoimmune hepatitis: a comprehensive review [J]. J Autoimmun, 2013, 41:126- 139. 3 Lohse AW, Mieli-Vergani G. Autoimmune hepatitis [J]. J Hepatol, 2011, 55(1): 171-182. 4 Okazaki K, Uchida K, Koyabu M, et al. IgG4 cholangiopathy: current concept, diagnosis, and pathogenesis [J]. J Hepatol, 2014, 61(3): 690-695. 5 Couto CA, Bittencourt PL, Porta G, et al. Antismooth muscle and antiactin antibodies are indirect markers of histological and biochemical activity of autoimmune hepatitis [J]. Hepatology, 2014, 59(2): 592-600. 6 Czaja AJ, Shums Z, Norman GL. Frequency and signifcance of antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas in variant autoimmune hepatitis [J]. Autoimmunity, 2002, 35(8): 475-483. 7 Zhao Y, Zhang Y, Liu YM, et al. Identification of T cell epitopes on soluble liver antigen in Chinese patients with auto-immune hepatitis [J]. Liver Int, 2011, 31(5): 721-729. 8 Heneghan MA, Yeoman AD, Verma S, et al. Autoimmune hepatitis [J]. Lancet, 2013, 382(9902): 1433-1444. 9 European Association for the Study of the Liver. EASL clinical practice guidelines: autoimmune hepatitis [J]. J Hepatol, 2015,63(4): 971-1004. 10 Gleeson D, Heneghan MA, British Society of Gastroenterology. British Society of Gastroenterology (BSG) guidelines for management of autoimmune hepatitis [J]. Gut, 2011, 60(12): 1611-1129. 重磅推荐 慢性肝病是严重危害我国人民健康的最常见疾病之一，自身免疫性肝病作为一种特殊类型的慢性肝病，因其病因和发病机制尚不完全明了，且高发病率和高死亡率，越来越受到我国消化和肝病学界专家及临床医师们的关注。 《自身免疫性肝病基础与临床》于2006年出版，是国内首部关于自身免疫性肝病的专著，出版后广受业界专家和读者好评。随着医学的快速发展，近15年来免疫学领域取得了许多突破性的进展，为了更好地适应广大临床医生、医学生、科研工作者和患者的需要，上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科马雄教授和邱德凯教授综合近年来国际上最新的研究进展和欧美肝病学会共识指南，并结合中国人自身特点，对《自身免疫性肝病基础与临床》做了重要补充和全新修订。 主编简介 马雄 ▎ 国家杰出青年科学基金获得者、百千万人才工程国家级入选者、上海交通大学特聘教授、享受国务院特殊津贴专家。现任上海市消化疾病研究所副所长，上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科副主任。兼任国际自身免 疫性肝炎工作组（IAIHG）成员、中华医学会肝病学分会 委员、上海市医学会肝病专科委员会委员。承担国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金国际合作与交流项目和多项面上项目。入选上海市浦江人才、上海市优秀学术带 头人和上海市领军人才等。在Gut、Hepatology 等杂志发 表 SCI 论著40 余篇。担任Journal of Hepatology、Journal of Autoimmunity、Journal of Digestive Diseases、Journal of Clinical and Translational Hepatology 等国际期刊编委。 擅长疑难肝胆疾病特别是自身免疫性肝病的诊治，特别注重转化医学研究，研究方向主要为肝脏免疫微环境的 调控。2015 年牵头撰写我国首部自身免疫性肝炎共识意见， 并参与另三部共识意见的撰写；受邀参加国际自身免疫性 肝炎工作组（中国仅 2 人），并参与发起“原发性胆汁性肝 硬化”更名为“原发性胆汁性胆管炎”的倡议，得到国际肝病界的广泛响应。 邱德凯 ▎ 1965 年毕业于上海第一医学院（医疗系）。毕业后一 直在上海交通大学医学院附属仁济医院消化科工作。享受国务院特殊津贴专家。担任上海市卫生专业技术二级岗位（二级教授）、上海市医学会资深会员。历任上海市消化疾病研究所所长、仁济医院消化科主任、卫生部消化内科重点实验室副主任及上海市消化学会副主任、上海肝病研究中心副主任、上海市消化疾病专家诊治中心副主任、国际 外科和消化内科医师协会（IASG）上海分部消化内科主席、 上海市医师协会消化内科医师分会顾问和上海市医学会消化病学分会自身免疫性肝病学组顾问等。 |
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