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免疫球蛋白基因的研究近年来获得重大突破。日本学者利根川进（Tonegawa)因在免疫球蛋白基因结构研究有突出贡献而获得1987年诺贝尔医学和生理学奖。应用X结晶衍射分析、DNA序列分析和园双色等技术研究表明，许多细胞膜表面分子和机体某些蛋白分子多肽折叠方式与Lg相似，在氨基酸组成上与免疫球蛋白可变区（V区）或/和恒定区（C区）有较高的同源性，它们可能从同一祖先基因（primordial ancestral gene)进化而来。编码这些多肽链的基因称为免疫球蛋白基因超家族（immunoglobulin gene superfamily),这一基因超家族所编码的产物称为免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IGSF)。 Ig超家族中某些成员如FascilinNeuroglian和Amalgam等分子存在于昆虫中，这表明Ig超家族结构域的多样化（diversification)在后生动物（Metazoon)进化早期即开始发生，通过基因的复制（duplication)和随后发生的偏离（divergence)产生了具有不同功能的多功能域结构。 第一节 免疫球蛋白超家族的组成和特点一、Ig超家族的组成由于细胞表面标志、单克隆抗体以及基因工程技术的应用，发现越来越多的膜表面分子和蛋白分子属于Ig超家族，主要包括T细胞、B细胞识别抗原受体及其信号转导分子，免疫球蛋白重链和轻链，MHC抗原及相关分子，免疫球蛋白Fc段受体，某些细胞因子受体，与神经系统功能和粘附有关的分子，某些粘附分子和分化抗原等（表3-1）。 表3-1 免疫球蛋白超家族的组成（举例）
续表1
续表2
从表3-1中可以看出，不同组Ig结构域的类型和数目有以下特点： （1）识别抗原和信号转导组中，Igμ、γ、δ、ε和α重链各含1个V区，3～4个C1区；Igκ、λ轻链各含1个V区和1个C1区；TCRα、β、γ和δ链各含1个V区和1个C1区；CD3γ、δ和ε链只含1个C2区（CD3ξ和η链结构与IGSF无同源性）。 （2）MHC抗原及相关分子只含1个C1区，Qa/TL或CD1与β2m组成异源二聚体与MHCⅠ类抗原结构相似，MHCⅠ类分子α1、α2结构域，MHCⅡ类分子α1、β1结构域具有多态性，但其结构不属于IGSF。 （3）免疫球蛋白Fc受体基因均定位于1号染色体，除polyIgR外，其余IgFc受体的Ig结构域为2～3个C2区。 （4）IL-6Rα链、gp130和G-CSFR的胞膜外结构除N端各含有1个C2样区外，靠近胞膜侧各有一个红细胞生成素受体超家族结构域，此外，还有2～4个纤粘连素结构域。 （5）与神经组织细胞粘附有关的粘附分子中绝大多数含有5个或6个C2区。 二、Ig超家族的特点（一）Ig超家族的结构特点 Ig超家族成员均含有1～7个Ig样结构域，每个Ig样结构域约含70～110个氨基酸残基。其二级结构是两个各含3～5个反平行β折叠股所形成的β片层（anti-parallel β-pleated sheet)平面，每个反平行β折叠股由5～10个氨基酸残基组成，β片层内侧的疏水性氨基酸起到稳定Ig折叠的作用。大多类结构域内有一个垂直连接两个β片层的二硫键，组成二硫键的两个半胱氨酸之间约含55～75个氨基酸。少数Ig结构域如CD2、LFA-3第1个结构域，PDGFR第4个结构域，CD4第3个结构域等缺乏二硫键。肽链这种球形结构的折叠方式称为免疫球蛋白折叠（Ig fold)。
图3-1 人Igλ轻链多肽的折叠（示意图） 不同IGSF分子穿膜区结构差异较大，Thy-1缺乏胞浆部分，通过一个GPI锚连接在细胞膜上，而PDGFR胞浆区含有543个氨基酸残基，并具有酪氨酸激酶的结构。除CD4第一个结构域和N-CAM分子外，Ig超家族中的一个结构域通常由一个外显子所编码。有些Ig超家族成员的基因连锁在一起，如Thy-1，N-CAM，CD3γ、δ、ε链的基因在11q23。Ig Fc段受体FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ和FcεRⅠα链基因在1q23-q24。 根据IGSF结构域中Ig折叠方式、两个半胱氨酸之间氨基酸残基的数目以及IgV区或C区同源性的程度，IGSF结构域可分为V组、C1组和C2组。
图3-2 免疫球蛋白超家族V组、C1组和C2组（举例） 1.V组 V组结构域的两个半胱氨酸之间含有氨基酸数量较多，约65～75个氨基酸残基，2个β片层区共有9个反平行β折叠股，比C1、C2组多一对β折叠股。许多IGSF分子具有V组结构，如IgH链和L链V区，TCRα、β、γ、δ链V区，CD4V区，CD8α、β链V区，CD28、CTLA-4、CD7、Thy-1、pIgR和分泌型IgA中分泌成分N端四个结构域，CEaN端第一个结构域，M-CSFR、SCFR和PDGFR靠近胞膜的结构域等。 2.C1组 又称C组。C1组结构域中二个半胱氨酸之间约含50～60个氨基酸残基，有7个β折叠股，如IgH链和L链C区（γ、δ和α链的CH1～CH3或μ和ε链的CH1～CH4），TCRα、β、γ、δ链C区，MHCⅠ类分子重链α3结构域，β2m、MHCⅡ类分子α2和β2结构域，CD1、Qa 和TL分子靠近胞膜结构域等。 3.C2组 又称H组。C2组结构域的氨基酸排列类似V组，但形成二硫键的两个半胱氨酸之间所含氨基酸残基数约为50～60，有7个β折叠股，这种结构介于V组和C1组之间，如CD3γ、δ和ε链，CD2和LFA-3（CD58），pIgR靠近胞膜结构域，FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FcεRⅠα链、FcαR、ICAM-1，CEA第2至7个结构域，IL-6R、M-CSFR、G-CSFR、M-MAG、SCFR、PDGFR第1至4个结构域，与神经系统相关的分子N-CAM、N-CAM-L1、MAG、Po、F3、NILE、TAG1等以及CD22、CD48、α1-BgP分子等。某此IgH链中CH2和CH3可有8个β折叠，在这种情况下，其中一个β折叠股只有3个氨基酸残基。 在V、C1和C2三组中，有些Ig超家族成员之间的同源性要大于该组中平均的类似程度，如在V组中IgV、TCR-V、和CD8V结构域；C1组中IgC、TCR-C、MHC-C结构域；C2组中CD2和LFA-3，NCAM、NCAM-L1和MAG，PDGFR、M-CSFR和SCFR，这些同源性较高的成员它们的功能往往也很相似。 （二）Ig超家族的功能特点 Ig超家族的功能是以识别为基础，因此又称为识别球蛋白超家族（cognoglobulin superfamily)。Ig折叠形成一个紧密的球状结构，提供了与不同球状结构多肽或化学基团粘附的部位，使之获得不同的生物学功能。IGSF很可能最早起源于原始的具有粘附功能的基因，通过复制和突变衍生形成了识别抗原、细胞因子受体、IgFc段受体、细胞间粘附分子以及病毒受体等不同的结构域。IGSF识别的基本方式有以下几种。 1.IGSF和IGSF相互识别 IGSF分子相互识别中有嗜同种的相互作用和异嗜性相互作用两种形式。（1）嗜同种的相互作用（homophilic interaction)：如相同神经细胞粘附分子（NCAM）之间的相互识别，血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1，CD31）的相互识别。（2）异嗜性相互作用（heterophilic interaction)，如CD2与LFA-3，CD4与MHC Ⅱ类分子的单态部分（α2和β2），CD8与MHCⅠ类分子的单态部分（α3），PolyIgR与多聚Ig，FcγRⅠ（CD64）、FcγRⅡ(CD32)、FcγRⅢ（CD16）与Ig Fc段，FcεRⅠ与IgE Fc段，FcαR（CD89）与IgA Fc段，CD28与B7/BB1（CD80）等之间的相互识别。 2.IGSF和integrin相互识别 如ICAM-1（CD54）、ICAM-2（CD102）、ICAM-3（CD50）与LFA-1（CD11a/CD18），VCAM-1（CD106）与VLA-4（CD49d/CD29)之间的相互作用。 3.IGSF和其它分子的相互识别 包括TCR识别MHCⅠ类或Ⅱ类分子与抗原复全物，细胞因子受体识别细胞因子等。 三、CD、粘附分子与Ig超家族的关系免疫分子的命名根据不同的角度往往有不同的归类和命名，图3-3归纳了人白细胞分化抗原（CD）、粘附分子（AM）、免疫球蛋白超家族（IGSF）、细胞因子受体（CKR）、补体受体（CR）以及主要组织兼容性复合体抗原（MHC）等免疫分子命名的相互关系。 （1）A表示CD命名范围中的粘附分子，如CD49a/CD29、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD49e/CD29、CD49f/CD29、CD51/CD29、CD11a/CD18、CD11b/CD18、CD11c/CD18、CD41/CD61、CD51/CD61、CD49f/CD104、CD2、CD4、CD8、CD28、CD31、CD50、CD54、CD56、CD58、CD80、CD102、CD106、CD62L、CD62P、CD62E、CD15、CD15s、CD44等。 （2）B表示CD命名范围中属IGSF结构的分子，如CD79a、CD79b、CD1、CD64、CD32、CD16、CD115、CD117、CDw121a、CDw121b、CD126、CDw130、CD2、CD4、CD7、CD8、CD19、CD28、CD31、CD48、CD50、CD54、CD58、CD66e、CD80、CDw90、CD96、CD102、CD106、CD56等。 （3）C表示粘附分子中属IGSF结构的分子，无CD编号，如MHCⅠ类和Ⅱ类分子。 （4）D表示CD命名范围中，具有粘附功能且属于IGSF结构的分子，如CD2、CD4、CD8、CD28、CD31、CD50、CD54、CD56、CD58、CD80、CD102、CD106等。 （5）有CD命名的CR有CR1（CD35）、CR2（CD21）、CR3（CD11b/CD18）、CR4（CD11c/CD18）和C5aR(CD88)，其中CR3和CR4属于粘附分子中整合素超家族成员。 （6）有CD编号的CKR有CD115～CDw130；属于IGSF结构的CKR有CD115、CD117、CDw121a、CDw121b、CD126、CDw130、G-CSFR、PDGFR和VEGFR等。
图3-3 免疫分子命名的相互关系 第二节 免疫球蛋白基因的结构和多样性表3-2 免疫球蛋白基因定位
免疫球蛋白（Ig）的分子由IGK、IGL和IGH基因编码。IGK、IGL和IGH基因定位于不同的染色体（表3-2）。编码一条Ig多肽链的基因是由胚系中数个分隔开的DNA片段（基因片段）经重排而形成。1965年Dreyer和Bennet首先提出假说，认为Ig的V区和C区由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。1976年Hozumi和Tonegawa应用DNA重组技术证实了这一假说。 一、 Ig重链基因的结构和重排Ig重链基因是由V、D、J和C四种不同基因片段所组成。 （一）Ig重链可变区（V区）基因 重链可变区基因是由V、D、J三种基因片段经重排后所形成。 1.重链V区基因的组成 编码重链V区基因长约1000～2000kb，包括V、D、J三组基因片段。 （1）重链V基因片段：小鼠VH基因片段数目为250～1000个。根据VH基因片段核酸序列的相似性（>80%同源性），至少可分为11个家族（family).人V基因片段约为100个，至少可分为6个家族，每个家族含有2～60个成员不等。V基因片段由2个编码区（codingregions)组成：第一个编码区编码大部分信号序列；第二个编码区编码信号序列羧基端侧的4个氨基酸残基和可变区约98个氨基酸残基，包括互补决定区1和2（complementarity determining region 1和2，CDR1和CDR2）。 （2）重链D基因片段：D（diversity)是指多样性。DH基因片段仅存在于重链基因中而不存在于轻链基因。D基因片段编码重链V区大部分CDR3。小鼠DH共有12个片段，位于VH和JH基因片段之间，大部分DH片段较为集中，约占60～80kb，但靠上游的DH可能位于VH区域内，最后一个DH片段与JH基因5'端相距约0.7kb。人类DH片段可能有10～20个左右。 （3）重链的J基因片段：J（joining)指连接，是连接V和C基因片段。JH编码约15～17个氨基酸残基，包括重链V区CDR3除DH编码外的其余部分和第4骨架区。小鼠JH基因片段有4个，与Cμ相距约6.5kb。人有9个JH，其中6个是有功能的JH基因片段。 V、D、J基因片段经重组连接在一起，组成2个外显子，一个外显子编码信号序列的大部分，另一个外显子编码信号序列的其余部分和重链可变区。 小鼠和人在胚系中Ig基因的结构见图3-4和图3-5。 2.重链可变区基因的移位 在重链基因重排开始时，二条染色体上都发生D基因片段移位到J基因片段而发生D-J基因连接。在此以后，只有其中一条染色体上的V基因片段与D-J基因片段连接。VH基因片段5'端含有启动子（promoter)，JH和Cμ基因片段之间的内含子中含有转录增强子（transcriptinalenhancer)。如果一条染色体VH基因与D-J基因重排无效（non-productive），另一条染色体的VH基因片段开始发生移位，与D-J基因片段连接。 某些与Ig基因片段重排有关的特殊序列称为识别序列（recognition sequences)，位于V基因片段的3'端与J基因片段的5'端之间以及D基因片段的两侧。V基因片段3'端、J基因片段5'端以及D基因片段的两侧也是DNA重排识别信号所在区域，这些识别信号包括三部分：（1）高度保守的回文结构的七聚体（palindromic heptamer);(2)较少保守、富含A/T的九聚体(nonamer);（3）七聚体和九聚体之间不保守的间隔序列（spacer sequence)，含有12±1碱基对或23±1碱基对。根据12/23碱基对间隔规则（或称1圈/2圈定律），两个基因片段的重组仅发生在两个基因片段之间：各有一个12个碱基对片段和一个23个碱基对片段的结构（图3-6）。
图3-4 小鼠Ig基因结构 注：（1）L：先导序列基因片段 V：可变区基因片段 D：D基因片段 J：J基因片段 C：恒定区基因片段 E：转录增强子 S：转换区 *：假基因 （2）内含子区域所标数字表示DNA长度（kb)。 （3）每个CH基因用一个方框表示，实际上包括几个外显子，如Cμ含有6个外显子。 （4）λ基因增强子位于Cλ4和Cλ1基因片段的下游。
图3-5 人Ig基因结构 注：（1）L：先导序列基因片段 V：可变区基因片段 D：D基因片段 J：J基因片段 C：恒定区基因片 *：假基因 （2）内含子区域所标数字表示DNA长度（kb) （3）每个CH基因用一个方框表示，实际上包括几个外显子 参与V/（D）/J基因重组过程的酶称为V/（D）/J重组酶（recombinase),有关于执行识别、切割和重新连接基因片段重组酶的纯化和鉴定工作还刚开始。重组酶实际上包括重组过程中多种酶的活性。最近在前B细胞（pre-b cell)中已经鉴定出两种刺激Ig基因重排的基因，称为重组激活基因1（recombinationactivating gene 1,RAG-1）和重组激活基因2（RAG-2），其确切的作用机理还不太清楚。重组酶作用的特点是：（1）淋巴细胞特异性的，非淋巴样细胞如成纤维细胞无重组酶活性，这可能解释了Ig基因的重排仅见于B淋巴细胞。目前一般认为T细胞TCR基因重排中的重组酶与B细胞中重组酶相同或相似。（2）重组酶发挥其功能仅限于B细胞发育早期，未成熟B细胞如前B细胞（pre-b cell)细胞系重组酶活性很高，但抗体生成细胞或骨髓瘤细胞无明显重组酶活性，因此时B细胞已经分泌某一特异性抗体，不再发生重排其它的Ig基因，因此也不会改变原先所产生抗体的特异性。转换重组酶（switch recom-binase)可能与VDJ重组酶（VDJ recombinase)相似，但缺乏七聚体/九聚体（heptamer/nonamer）识别蛋白。重组酶功能异常可导致机体不能产生Ig和TCR，很可能与重症联合免疫缺陷(severe combinedimmunodeficiency,SCID)的发生有关。例如SCID小鼠16号染色体着丝点末端存在一个scid基因，为单基因常染色体遗传基因。scid基因纯合将影响DNA重组酶的识别功能，在TCR或BCR基因片段重排时不能识别正确的位点，使T细胞、B细胞在淋巴干细胞发育早期即夭折，导致重症联合免疫缺陷。
图3-6 参与Ig基因重排组酶识别的DNA序列 （二）Ig重链恒定区（C区）基因 1.重链C基因片段 重链恒定区基因由多个外显子组成，位于J基因片段的下游，至少相隔1.3kb。每1个外显子编码1个结构域（domain)，铰链区（hinge region)是由单独的外显子所编码，但α重链的铰链区是由CH2外显子的5'端所编码。大多分泌的Ig重链羧基端片段或称尾端“tail piece”是由最后一个CH外显子的3'端所编码，而δ链的“tailpiece”是由一个单独的外显子所编码。小鼠CH基因约占2000kb，其外显子从5'端到3'排列的顺序是Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cγ2b-Cγ2a-Cε-Cα。人CH基因外显子排列的顺序是Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cε2（pseudo基因）Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε1-Cα2。其中基因片段Cγ3-Cγ1-Cε2-Cα1和基因片段Cγ2-Cγ4-Cε1-Cα2可能是一个片段经过一次复制而得，为研究CH基因的起源和进化提供有用的依据。 2.免疫球蛋白类型转换 1964年Nossal等发现B淋巴细胞存在着类型的转换。Ig类型转换（class switch)或称同种型转换（isotype switch)是指一个B淋巴细胞克隆在分化过程中VH基因片段保持不变，而发生CH基因节段的重排、比较CH基因片段重排后基因编码的产物，V区相同而C区不同，即识别抗原特异性不变，而类或亚类发生改变。这种类型转换在无明显诱因下可自发产生。 局部微环境和细胞因子可影响和调节免疫球蛋白类型的转换，如在肠道派伊尔氏结的B细胞V基因片段优先转换到Cα1进行重排，因此主要合成和分泌IgA。在体外向经LPS刺激的小鼠B细胞中加入IL-4，可促进B细胞产生IgG1和IgE，抑制IgG2b产生；低浓度的IL-4主要诱导产生IgG1，高浓度IL-4主要诱导产生IgE。面IFN-γ则诱导小鼠B细胞合成IgG2a，抑制IgE的产生。TGF-β、IL-5和IL-6对IgA的产生具有促进作用（表3-3）。细胞因子调节B细胞Ig类别转换的机理可能是：（1）刺激某些细胞的克隆选择性的增殖，使分泌某特定类、亚类抗体的克隆细胞增加，如IL-5、IL-6促进IgA。产生除通过同种型转换进行调节外，还可选择性促进IgA定向细胞分化增殖为IgA分泌细胞。（2）通过诱导特定位置上两个转换区的重组，诱导B细胞由分泌IgM向某一同种型Ig转换。如高浓度IL-4促进LPS诱导小鼠B细胞产生IgE，主要是使Cε转换区与重组酶的接近（accessibility),通过同种型转换促进IgE的产生。 表3-3 细胞因子对LPS诱导的Ig类和 亚类转换的调节作用（占总Ig%）
注：（1）纯化的小鼠IgM+IgD+B细胞体外培养时，加入不同的细胞因子和LPS，然后检 LPS，然后检测不同类或亚类免疫球蛋白的百分比。 （2）由于未检测所有类和亚类Ig，所以每组Ig总百分比不到或接近100%。 Ig类型转换可能通过以下两种机理。 （1）缺失模型（deletion model):又称linear orderly deletiom ofH chain genes。以小鼠CH基因为例，如Cμ和Cδ基因片段被缺失，那么先前重排的VDJ就会按照顺序与下一个CH基因即Cγ3发生重排，经转录和翻译后，编码γ3重链；如缺失所有的γ链亚类基因，依次会产生ε链。上述模型在被刺激后小鼠B细胞在体外培养中产生Ig类别的顺序得到证实，即先产生IgM，然后依次产生IgG3和IgG1等。但这个模型不能解释免疫动物或抗原刺激B细胞培养中单个B细胞可同时表达几种不同类或亚类的重链。 （2）RNA的不同剪接：除DNA水平的Ig类型转换形成外，RNA水平的不同剪接（alternative RNA splicing）也可产生不同的Ig类型。 Cμ和Cδ基因片段之间无S区，IgM和IgD共表达的B细胞系DNA分析表明，Cμ和Cδ基因片段没有发生重排，相同的VH出现在μ或δ链的mRNA上，表明它们可能有一个共同的mRNA前体，通过不同的或差异剪接（differential splicing)分别形成μ链和δ链mRNA。初级RNA转录本（primary RNa transcript)是由VDJ复合体连接Cμ和Cδ基因片段经转录后形成。如果在剪接过程中切除初级RNA转录本中的Cδ部分，经加工后形成μmRNA；如去除初级RNA转录本中的Cμ部分，则加工后形成δmRNA。这两种mRNA分别被翻译，使单个B细胞同时产生μ和δ链，同时表达IgM和IgD。同样的机理可从一条长的primary RNA转录本中加工为 μmRNA和εmRNA（或其它重链mRNA），同时表达IgM、IgE或其它类Ig。
图3-7 Ig类型转换缺失模型 （三）膜表面Ig重链基因 膜表面Ig（mIg)重链基因的外显子结构与分泌性Ig重链的基因外显子结构基本相同，但在基因组的3'端有所不同。作为识别抗原受体的mIg，其重链羧基端有一段疏水性氨基酸插入到胞膜双层脂质中，mIg重链的转录本要比分泌性重链转录本多1～2个外显子，与分泌性重链基因最后一个外显子至少相隔1.4kb,这1～2个外显子编码重链的羧基端部分，这部分氨基酸残基的数目视重链不同而有所差异，如鼠或人mIgμ链的这一部分约为41个氨基酸残基，而鼠mIgε链这部分却有72个氨基酸残基。这个区域可分为三个部分：（1）一个酸性间隔子，靠氨基端侧，与最后一个CH结构域相连，位于细胞膜外侧；（2）跨膜部分，由26个不带电荷的疏水氨基酸形成一个α螺旋，穿过胞膜的脂质双层；（3）胞浆内羧基端部分，3～28个氨基酸残基不等，可能与信号传递有关。
图3-8 RNA的差异拼接与IgM和IgD共同表达在一个B细胞上 分泌形式的μ、α和δ重链最后一个结构域后有一段额外延长的由带电荷氨基酸组成的序列，称为尾片（tail pieces)，约含20个氨基酸，在IgM和IgA分子中，单体Ig尾片通过二硫键相互连接或与J链形成二聚体或多聚体。分泌形式μ链的mRNA含有V、D、J、Cμ1、Cμ2、Cμ3、Cμ4和Cμ43'端一个小的外显子转录区。 Ig重链基因除L、V、D、J和C基因片段外，在内含子中还有一些与mRNA转录和免疫球蛋白类的转换有关的结构。 （1）插入顺序（intervening sepuence,IS)：有IS1、IS2、IS3……等。 （2）转换区序列：即S区（switch region)。除Cδ外，各个恒定区基因片段上游都有一个同源重复序列的S区，约占2～10kb，分别命名为Sμ、Sγ、Sα和Sε等，与Ig类和亚类的转换有关。S区含有众多串联的高度保守的DNA重复序列，每个重复序列可长到52bp，其确切的功能还不清楚。如Sμ的结构为[（GAGCT）nGGGGT]m，n一般为2～5，但有时可达17，m可达150。目前关于H链转换区的研究主要以小鼠为模型，如4个Sγ是由49bp长的基序的重复序列所组成。Sα至少由长为80pb的15个重复序列，Sε的重复序列长为60bp。在小鼠，B淋巴细胞经T细胞非依赖性活化后常发生Sμ/Sγ3和Sμ/Sγ2b的重组，因此在无T细胞存在条件下，LPS活化小鼠B细胞成为淋巴母细胞，主要转换Ig的亚类为IgG3和IgG2b。 （3）启动子：靠近每个V基因转录位点的上游，含有TATA盒，控制RNA多聚酶Ⅱ作用下的转录过程。大多数Ig的启动子含有许多DNA序列，包括一个保守的8个核苷酸序列，可能是核DNA结合蛋白（nuclear DNA-binding proteins)结合部位，在转录过程中起着重要作用。由于核DNA结合蛋白是由其它基因所编码，因此这种作用方式被称为反式作用（transacting).
图3-9 膜表面和分泌的Igμ基因及μ链羧基端结构的比较 注：（a）初级RNA转录本通过不同的剪接加工，分别形成分泌型μmRNA和膜型μmRNA。 （b）苏氨酸（T）为Cμ4第556位氨基酸。膜表面μ重链的556氨基酸后还有41个氨基酸，其中富含带负电氨基酸胞膜外区12个氨基酸，26个疏水性氨基酸组成的穿膜区以及胞浆区3个氨基酸；分泌型μ重链在556位氨基酸后有20个氨基酸组成的尾片，C末端倒数第二个为半胱氨酸。 （4）增强子（E）：在人和小鼠和重链和κ轻链中发现有增强子，其核苷酸序列为TGGTAAG。在H链基因中，增强子位于JH3'端侧。当H链VDJ或κ链VJ重排后，V基因上游的启动子靠近增强子，使V（D）JC基因重排后开始更为有效的转录。增强子作用方式与启动子不同，呈方向非依赖方式（orientation-independent manner),即增强子可作用于被转录基因的上游或下游。此外，增强子的作用是细胞特异性。 已重排Ig基因的转录起始于TATA盒下游约20核苷酸处，转录至C基因后，产生初级RNA（primary RNA)转录本，在3'端切断后进行多聚腺苷酸化（polyadenylation),剪接掉不编码的内容含子，如J区与C区之间的不编码序列是在RNA水平上被剪接掉。
图3-10 小鼠μ链的基因重排顺序、转录和合成 （四）重链基因重排、转录和多肽链的合成。 以μ链基因的重排顺序、转录和μ链合成为例，见图3-10。 二、Ig轻链基因的结构和重排在Ig重链基因重排后，轻链的可变区基因片段随之发生重排，V与J基因片段并列在一起。κ轻链基因先发生重排，如果κ基因重排无效，随即发生λ基因的重排。 （一）κ链基因的结构和重排 在小鼠，Vκ基因片段约有250个，间隔距离平均为10～12kb；Jκ有5个，其中4个有功能：Cκ只有1个。在人类，Vκ基因片段约有85～100个，编码V区氨基端的1～95位氨基酸，包括CDR1、CDR2和部分CDR3。根据DNA相似性程度，Vκ可分为16个组。在胚系DNA水平上，Vκ基因片段分散约占2000kb之长，占人2号染色体长度的百分之一左右。Jκ基因片段有5个，编码第96～108氨基酸。Jκ与最后一个Vκ基因片段的3′端相距为23kb，但与Cκ外显子靠得较近。Cκ也只有1个，编码C区（109～214氨基酸），所有κ轻链具有同一结构的C区。人和鼠Cκ距最后一个Jκ基因片段约2.5kb。Vκ与Cκ之间以随机的方式发生重组连接。人κ轻链V基因的排列多样性约为100Vκ×5Jκ=500。 （二）λ链基因的结构和重排 小鼠Igλ轻链基因结构见表3-4。在大多数近交系小鼠中，有4个Jλ和4个Cλ，根据其在胚系DNA上的分布位置可分为两组（cluster):Jλ2Cλ2Jλ4Cλ4(C2-C4组)和Jλ3Cλ3Jλ1Cλ1（C3-C1组），每组基因片段长约为5kb。 表3-4 λ链基因结构和编码的氨基酸
λ基因组中共含有Vλ1、Vλ2和Vλx3个Vλ基因片段，Vλ2与“C2-C4组”（Jλ2Cλ2Jλ4Cλ4）的5′端相距73kb；Vλ1与“C3-C1组”（Jλ3Cλ3Jλ1Cλ1）相距19kb；VλX与Vλ23′端相距19kb；Vλ重因片段与Jλ、Cλ基因片段的连接并不完全随机，Vλ1与Jλ3或J1重排，组成Vλ1Jλ3Cλ3基因或Vλ1Jλ1Cλ1基因，而Vλ2似乎只与Jλ2重排组成Vλ2Jλ2Cλ2基因，偶尔可见Vλ2与Jλ3或Jλ1重排，分别组成Vλ2Jλ3Cλ3基因和Vλ2Jλ1Cλ1基因。Jλ4、Cλ4不具备功能。目前尚未发现Vλ1与Jλ2重排。VλX只发现与Jλ2重排。 在人类，λ基因位于第22号染色体，Vλ约有100个，不同亚型含Cλ数量在6～9个之间，每个Cλ与各自的Jλ基因片段相邻。λ轻链的转录过程是某一个Vλ基因片段与某一个Jλ片段连接成Vλ/Jλ外显子，然后与邻近Cλ基因片段重组转录为初级mRNA，再通过mRNA的剪接、翻译及修饰，成为成熟的λ轻链。
图3-11 小鼠κ轻链基因重排顺序、转录和合成 三、免疫球蛋白基因表达的调节（一）核因子对Ig基因转录的调节作用 Ig基因转录活性是由两个顺式作用组件（cis-acting elements)即启动子（promoter,P）和增强子（enhancer,E)来调节。而启动子和增强子的功能又由反式作用的核因子（trans-acting nuclear factor)所控制。这些核因子也称为DNA结合蛋白（DNA-binding proteins,DBP)，结合到启动子或增强子内特异的核苷酸序列，从而抑制或刺激启动子和增强子的活性。许多种类细胞受到某些刺激后可诱导或活化特定的DBP。 1.ATGCAAAT序列及其核因子 Ig重链启动子含有8个保守的核苷酸序列ATGCAAAT，这个序列也存在于κ轻链的启动子、重链增强子以及许多非Ig的启动子中。B细胞Ig基因的转录依赖于启动子中这一完整的ATGCAAAT序列的存在。哺乳动物细胞中至少存在三种特异性结合ATGCAAAT的蛋白质，即Oct1、Oct2(OTF2A)和OTF2B。Oct1又称OTF1(octamer transcription factor 1),广泛存在于哺乳动物的细胞中；OTF2A和OTF2B为淋巴细胞特异性，活化Ig基因的转录。 2.GGGACTTTCC序列和NF-κB 小鼠κ链增强子含有GGGACTTTCC10bp 的序列，是一种称之为NF-κB(nuclearfactor of kappa B)DNA结合蛋白结合的靶序列。 （1）NF-κB结合靶序列的分布：NF-κB结合的DNA序列也存在于许多其它淋巴细胞、非淋巴细胞、病毒基因增强子和启动子以及HIV-1的长未端重复序列中，如某些MHCⅠ类基因，IL-2Rα链,TCRβ链,IL-2、IL-3、IL-6、IFN-α、IFN-β、IFN调节因子、GM-CSF、SV40基因等。在不转录κ基因的前B细胞（pre-b cell)系中无NF-κB活性，这些细胞用LPS处理后可诱导出有功能的NF-κB，随之也刺激κ链基因的转录。 （2）NF-κB结构及作用特点：NF-κB是一个异源四聚体复合物，包含两个与DNA结合的50kDa多肽和两个不与DNA直接结合的65kDa多肽链NF-κB解离常数在10-12～10-13M之间，这种高亲和力是它发挥功能所必需的。在大多数细胞系中由于抑制因子IκB与p65的偶联作用，使整个NF-κB分子以无活性的形式存在于细胞质内。IκB由于磷酸化（如PKC作用）或其它的修饰作用丧失功能，从NF-κB/IκB复合物上解离下来，洲离的NF-κB随即进入细胞核，结合靶基因的特定序列，从而激活这一基因的转录反应。如抗原结合到B细胞mIg后刺激B细胞内PKC活化。LPS也可活化PKC。NF-κB在有效合成κ链的骨髓瘤细胞中是无活性或是缺乏的，提示NF-κB和κ链基因的增强子在B细胞分化早期对于起始κ基因转录是需要的，但对于分化后期维持转录过程中并不是必需的。
图3-12 免疫球蛋白基因转录的调节 注：VDJ重排使启动子（P）靠近位于Jκ和Cκ之间的增强子，增加了已重排V2基因的转录水平，DNA结合蛋白NF-κB结合到增强子内靶序列，Oct1、Oct2可结合到启动子上。 （二）等位基因排斥现象 免疫球蛋白基因表达中一个重要的发现是等位基因排斥现象（allelic exclusion)。编码人Ig重链基因位于第14对染色体上，在B细胞发育过程中，这一对同源染色体中仅有一条染色体Ig基因得到表达。例如一个人B细胞内来自母本的染色体上的Ig重链基因得到表达，则来自父本的第14号染色体的Ig重链基因受到抑制而不表达。这可能是通过已发生有效重排的染色体产生反馈抑制（feedbackinhibition)信号抑制另一条同源染色体上的Ig重链基因发生重排。一条染色体上Ig重链基因的有效重排，一方面抑制了另一条同源染色体重链基因的重排，另一方面可发出信号使第2号染色体上Igκ轻链基因发生重排，如果一对同源染色体上的κ轻链基因重排均无效，才发生22号染色体λ轻链基因重排，这种现象称为轻链同种型排斥现象（light chain isotype exclusion)。 四、免疫球蛋白的多样性机体对外界环境中众多抗原刺激可产生相应的特异性抗体，有人推算抗体的多样性在107以上，这种抗体多样性主要是由遗传控制的。引起免疫球蛋白多样性的原因主要有以下几个方面。 1.胚系中众多的V、D、J基因片段 胚系（germ line)中未重排的（unrearranged) DNA有众多的V基因片段以及一定数量的D、J基因片段。以小鼠为例。VH、DH和JH基因片段分别为1000、12和4，单独重链重组的多样性可达4.8×104左右；Vκ和Jκ分别约为250和4，κ轻链V-J重排的多样性为1.0×103。经重链与κ轻链随机配对后推算的多样性为（4.8×104）×（1.0×103）=4.8×107。 表3-5 小鼠Ig胚系基因片段和重链、κ轻链配对的多样性
注：多样性数目不包括VDJ连接多样性、N区插入和体细胞突变所增加的多样性数目。 2.VDJ连接的多样性 轻链基因重排过程中，VJ连接点以及重链基因重排过程中D-J以及V-D-J连接点有一定的变异范围。例如轻链VL因片段3′端5个核苷酸CCTCC和JL基因片段5′端4个核苷酸GTGG连接时，9个核苷酸中只有6个核苷酸编码轻链第95、96位氨基酸，可产生8种不同的连接方式（图3-13）。 3.体细胞突变（somatic mutation) 体细胞在发育过程中可发生基因的突变。以长期体外培养的B细胞前体为例，每个细胞每个碱基对的突变率为1～3×10-5，这种类型突变主要发生在V基因。体细胞突变扩展了原有胚系众多基因片段的多样性。 4.N区的插入（insert of N region) 在Ig重链基因片段重排过程中，有时可通过无模板指导的机理（non-temple directed mechanism)在重组后D基因片段的两侧即VH-DH或DH-JH连接处插入称之为N区的几个核苷酸。N区不是由胚系基因所编码。在N区插入前，先通过外切酶切除VH-DH或DH-JH连接处的儿个碱基对，然后通过末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT）连接上N区。由于额外插入了N区，可发生移码突变（frameshift mutation),使插入部位以及下游密码子发生改变，从而编码不同的氨基酸，增加了抗体的多样性。
图3-13 轻链基因V-J连接多样性举例
图3-14 N区插入D-J连的接处（示意图） 5.轻链重链相互随机配对 如表3-5所示，小鼠重链与κ轻链随机配对后推算的多样性可达4.8×107，如果再加上重链与λ轻链的随机配对其多样性就更多了。 第三节 T细胞受体基因编码T细胞受体（T cell receptor,TCR)α、β、γ和δ链的基因定位于不同的染色体（表3-6）。人和小鼠δ基因都位于α基因的复合体中，均位于14号染色体；人TCRβ和γ链基因分别位于第7对染色体的长臂和短臂，小鼠β和γ链基因则分别位于第6和13号染色体。 表3-6 TCR多肽链基因定位
一、TCR基因的结构TCR基因的结构和重排与Ig基因有许多相似之处。在胚系中，编码TCR多肽链的DNA是由几个分隔开的DNA片段组成，在胸腺细胞中重排后，形成编码一条完整多肽的基因。TCR多肽链可变区基因是由2～4个基因片段通过重排连接在一起。V基因片段编码信号序列和可变区氨基端95～100个氨基酸残基；J基因片段编码可变区羧基端13～23个氨基酸残基。TCRβ、δ链V区基因除V、J基因片段外，还有1～2个D基因片段，编码V与J之间数个氨基酸残基。TCR不同多肽链可变区基因的重排可有V-J、V-D-J或V-D-D-J等几种方式。TCR多肽链C基因片段通常由3～4个外显子所组成，位于J基因片段的下游。与IgC基因片段不同，TCrC基因片段是由数个外显子编码一个结构域，如β链的连接肽（connectingpeptide)是由3个分隔的外显子所编码。 （一）TCRα链基因 TCRα链基因与TCRβ链和Ig基因结构有很大差别。小鼠α链V基因约100个，至少可分为12个家族。人Vα大约在100个左右，长约数百个kb。TCRα基因没有Dα基因片段。人和小鼠α链基因都含有J基因片段（Jα），小鼠约有60个，相互间隔至少500bp。VαJα连接具有多样性。TCRα链基因只有1个Cα基因片段，含有4个外显子。在TCRα链基因座中有TCRδ链基因。TCRα链基因重组信号中长的间隔序列（23bp)3′端靠近Vα，短的间隔序列（12bp)的5′端靠近Jα，这种重组信号的排列方式类似Ig轻链V区的基因，允许Vα基因直接与Jα基因重排，而不需要VD基因片段。 （二）TCRβ链基因 小鼠胚系中未重排的β链基因结构已经搞清，长约数百kb。Vβ基因数目约30个，大多数Vβ基因片段位于Cβ1的上游，至少有1个Vβ（Vβ14）在Cβ2基因3′下游10kb处，与转录的方向相反。人Vβ基因片段约有100个。小鼠和人都有2个Dβ基因片段，12～14bp长，分别位于Jβ1和Jβ2基因片段组上游约500～600bp处。小鼠和人都有2组（cluster)Jβ基因片段，称为Jβ1和Jβ2，与相应的Cβ1和Cβ2基因片段间隔2～3kb。小鼠Jβ1和Jβ2各含7个Jβ基因片段，其中6个有功能，Jβ基因片段相互间隔36～421bp。人Jβ1和Jβ2各含7个有功能的Jβ基因片段。人和鼠TCRβ基因都有2个基本相同的Cβ基因片段，各含4个外显子。Cβ1和Cβ2高度同源，2个Cβ基因片段的编码产物中只有4个氨基酸残基（小鼠）或5个氨基酸（人）不同。 TCRα和β链V基因编码区域包括了相当于Ig的CDR1和CDR2，主要是识别MHC分子和抗原的复合物。CDR3主要是由于V-D-J或V-D-D-J连接的多样性（junctionaldiversity)和广泛分布的N核苷酸插入（Nnucleotide insertion)所造成，其有高度的多样性，可识别众多种类的抗原。
图3-15 小鼠TCR基因的结构 （三）TCRγ链基因 Vγ基因片段数较少，在Balb/c小鼠Vγ基因片段有7个，分为5个家族，其中4个家族各只含1个Vγ，另一家族有3个Vγ。人Vγ有14个，其中8个是有功能的。人和小鼠TCRγ链基因均不含D基因片段。在小鼠，有4个Jγ基因片段，基中Jγ1、Jγ3和Jγ4分别位于3个Cγ基因片段的上游，Jγ3为假基因。在人类共有5个Jγ基因片段，可分为Jγ1和Jγ2两组，其中Jγ1的3个片段位于Cγ1上游，Jγ2的2个片段位于Cγ2基因片段的上游。不鼠有4个Cγ基因片段，其中Cγ3是假基因。人有2个Cγ基因片段，相距约10kb，其中1个Cγ有3个外显子，另一个Cγ含有4个或5个外显子。编码γ链连接肽部分的两个Cγ基因外显子组成存在着差异，有一个Cγ基因片段不编码半胱氨酸，因此造成了TCRγ链在分子量、N-连接糖基化的形式以及是否与TCRδ链之间形成二硫键有所不同。
图3-16 人TCR基因的结构 （四）TCRδ链基因 人和小鼠TCr δ链基因结构十分相似，均位于α链基因座内。在Balb/c小鼠，Vδ基因片段数约为8个。在小鼠δ链基因中有2个Dδ、2个Jδ和1个Cδ基因。在胸腺细胞分化过程中，δ链先于α链表达。Vα与Jα重排可导致δ基因复合物中D、J和C基因片段的缺失。在人δ链基因中有8个Vδ基因片段，2个Dδ、3个Jδ和1个Cδ。某些Vδ基因片段是与TCRα链Vα基因共用的。 TCRδ链基因连接信号的排列方式是：每个Vδ基因片段的3′端紧靠着“七聚体-长间隔序列-九聚体”（7-23-9）结构；Dδ基因片段5′端是“九聚体-短间隔序列-七聚体（9-12-7）结构，3′端是“7-23-9”结构；2个Jδ基因片段的5′端是“9-12-7”结构。这种TCRδ链基因重组信号排列的方式使得V、D、J链接可有以下几种不同方式：（1）V-D-J连接，在小鼠胚胎TCRγδ胸腺细胞最常见到Vδ-Dδ2-Jδ的连接，人胚胎胸腺细胞最常见到Vδ-Dδ3-Jδ；（2）V-J的直接连接；（3）大多数成年小鼠TCRγδ胸腺细胞以Vδ-Dδ1-Dδ2-Jδ连接，人妊娠后期胎儿TCRγδ胸腺细胞也存在着Vδ-Dδ1-Dδ2-Jδ的排列方式。Vδ基因位于Vα基因之中，同一个V基因片段可用作Vδ或Vα，如果V基因片段是用作Vδ，多发生V-D（-D）-J重排。 小鼠TCRγδ T细胞γ和δ链配对的，Vδ1几乎总是和Vγ5或Vγ6配对。小鼠TCRγδ阳性树突状表皮细胞（DEC）几乎都是Vγ5与Vδ1配对。在人Vδ2几乎总是与Vγ9配对。
图3-17 小鼠TCRβ基因重排顺序、转录和合成 二、TCR基因的重排T细胞在胸腺中发育成熟过程中，TCR基因按照一定的顺序发生重排。TCR基因的重排顺序和表达与免疫球蛋白基因的重排和表达十分相似。在基因组中的识别序列包括了一个保守的七聚体和九聚体，七聚体与九聚体之间含有一个不保守的12碱基对或23碱基对间隔序列（spacer sequence)。 TCRβ链基因座的重排要先于α链。首先是一个Dβ片段与一个Jβ片段连接，然后D-J与一个Vβ片段相连，完成了VDJ基因的重组。TCRβ链初级的RNA转录本在重组的VDJ和C基因之间含有内含子。VDJ与Cβ1或Cβ2的重排是随机的，目前尚未发现Cβ类似Ig重链类别转换那样从一个Cβ基因转换到另一个Cβ基因上。在小鼠Cβ2基因的3′端推测有一个增强子。 TCRβ链基因的功能性重排和表达，诱导了TCRα基因的重排。α链基因的重排与β链相似，由于α链基因不存在D片段，故α链基因只有V-J的连接。小鼠Vα转录起始点的5′端有一个启动子，Cα基因的3′端也有一个增强子。此外，靠近α链增强子处有“静息顺序”（silencersequences），这些顺序可抑制非T细胞或者是TCRγδT细胞中α链的转录。由于α链只有一个Cα基因，因此一旦初始的转录本形成后，经过RNA加工只能产生一种完整的α链mRNA。 如同Ig基因的重排和表达，TCRα和β链基因的重排和表达也有等位基因排斥现象（al-lelicexclusion),如果在一条染色体上TCR基因的重排是有效的，那末就可以抑制另一条染色体相应等位基因座的重排。当一条染色体上α链或β链基因座的重排、转录或翻译无效时，则另一条染色体上相应α或β链相应的等位基因座开始发生重排。如果两条染色体上TCRα或β链基因重排都无效，则未成熟的T细胞死亡。 三、T细胞库的多样性推测T细胞库（T cell repertoire)中多样性在1010以上，其多样性的原因与Ig相似，主要有以下几方面。 1.胚系中有众多的V、D和J基因片段 尽管TCRα和β基因中V基因片段数比Ig基因少，但J基因片段明显比Ig基因为多，如小鼠中约50～100个Jα和至少12个Jβ基因片段，而IgH和κ链基因座中J基因片段各只有4个。 2.连接处连接的多样性 与IgVDJ连接的多样性相似。 3.N区的插入 N区插入在Ig基因重排中只发生在重链基因，而TCRα和β链基因均可发生N区的插入。此外，在TCRα和β链基因中都发现一种称之为“易变性”（flexibility)的现象，如有一个以上Vα基因3′端可以连接到Jα片段。 4.TCRα与β链的随机配对 人TCRαβ库多样性可推算为：α链（Vα（100）×Jα（100））×β链（Vβ（100）×Dβ（2）×Jβ（14））=2.8×107，这种多样性尚未包括N区插入所扩展的多样性。 |
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来自： 潇湘剑客WJH > 《细胞和分子免疫学》
