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真皮老化是一个复杂的过程，其细胞外基质（ECM）的非胶原成分会发生许多变化。弹性蛋白随产量减少而下降，弹性纤维出现钙化并导致其功能退化。弹性蛋白网在结构和理化特性上的改变也会随年龄增长而不断累积。核心蛋白聚糖和多能蛋白聚糖的硫酸糖胺聚糖（GAG）链会发生改变，有研究表明，其多糖链的相对分子质量会降低。另外，随着年龄增长，成纤维细胞生成透明质酸（HLA）的量也会减少，导致其在真皮中含量降低，且在表皮中还会完全消失；所生成的HLA的GAG链也会逐渐缩小。  在皮肤老化过程中，ECM的胶原蛋白和弹性蛋白都会经历酶促和非酶促交联反应。赖氨酰氧化酶（LOX）是在ECM、真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞中发现的一种酶。LOX通过交联来防止纤维弹性过大，同时协助其沉积，这样可以保持胶原蛋白的排列和纤维结构，在维持弹性蛋白内稳态中起重要作用。皮肤中的LOX活性高于其他组织，老年人皮肤中其表达增加。然而，与ECM中的其他共价交联相比较，LOX导致的交联比例会随着年龄的增长而降低。该研究显示，相比LOX诱导的酶促交联，自然老化与非酶促（糖化）的交联相关性更大。 在胶原蛋白被分泌至真皮ECM中组装成超分子结构时，胶原蛋白会经历不可逆的非酶促糖化反应，导致晚期糖化终产物（AGE）在胶原蛋白基质中蓄积。AGE的蓄积会影响ECM的其他组分，包括真皮和表皮内稳态。 本研究对比不同年龄的两组（3名 < 30岁的年轻志愿者和4名 > 60岁的年长志愿者）健康白种人志愿者的皮肤活检样本，使用结合计算分析的纳米组织学方法，探讨自然老化引起的AGE蓄积对胶原蛋白机械性能的影响。 
对比1名28岁志愿者和1名82岁志愿者的真皮组织横切面染色切片，研究年龄对皮肤样本结构的影响。HE染色显示，年长志愿者表皮层自身的厚度变化显著（不均一），而年轻志愿者厚度则很均一。最大的结构性差异是在Pico Sirius Red染色切片中观察到的，即对于真皮内胶原蛋白支架的整个超微结构，年长者真皮多孔，胶原层间存在很大的缝隙；而年轻者虽然也能观察到一些不连续的大缝隙，但整体较致密。 为了研究老化对真皮胶原四级结构的影响，对真皮网状层进行原子力显微镜（AFM）和扫描电镜（SEM）成像。年轻者（28岁）真皮网状层的胶原蛋白支架超微结构SEM图像显示，该区域中存在致密的胶原蛋白板，横切面上可观察到高度有序的胶原蛋白纤维结构；AFM图像中周期性出现的高对比度D带是胶原蛋白四级结构的指纹图谱，两个致密胶原蛋白层的交叉点图像表明，致密的带状胶原蛋白也存在于真皮基质深层。总之，年轻志愿者的胶原蛋白支架超微结构可概括为：有周期性和高对比度D带的致密且紧凑的支架结构。年长者（82岁）组织切片的胶原蛋白超微结构变化显著，真皮网状层胶原蛋白支架SEM图像显示，纤维结构呈碎片状，没有整体凝聚力；胶原蛋白支架是多孔的，在纤维束间存在簇状间隙；同一区域的AFM图像证实，纤维丝的分布和走向是随机的，处于退化阶段的胶原蛋白纤维没有特征性的周期性D带。因此，年长志愿者胶原蛋白支架的超微结构可以被概括为一个失去了周期性和D带纤维结构的多孔碎片状支架。
使用AFM，对7名志愿者的组织切片直接进行系统性机械测量，可获得胶原蛋白一系列的局部力-距离曲线。AFM测量的胶原蛋白机械特性可以根据纤维的水合程度而改变。为了评价水合作用对胶原蛋白机械特性的影响，在同样的切片上进行两组测量：首先在脱水环境下进行测量，接着在磷酸盐缓冲液中水合10 min后重复同样的测量。在纤维水合的情况下，纤维平均杨氏模量Ey-hyd、Nfibrils在年轻志愿者中分别为（1.24 ± 0.09） MPa、63，在年长志愿者中分别为（0.89 ± 0.05） MPa、64。在纤维风干、脱水的情况下，纤维平均模量Ey-dehyd、Nfibrils在年轻志愿者中分别为（6.84 ± 0.64） GPa、128，在年长志愿者中分别为（4.03 ± 0.38） GPa、126。正如预期，样本脱水的结果是胶原蛋白的硬度急剧增加。然而，两组水合样本（年轻人和老年人）的杨氏模量值无显著性差异（P = 0.001），而两组脱水样本（年轻人和老年人）的杨氏模量值具有显著性差异（P < 0.001）。值得注意的是，年轻人脱水样本的杨氏模量呈双峰分布，第一峰以平均Ey.dehyd.mode.1 3.31 GPa为中心，与年长者的平均杨氏模量相似；第二峰以平均Ey.dehyd.mode.2 5.70 GPa为中心。实验中，组织切片再次水合处理对样本的稳定性具有显著的影响，因为有超过9/10的组织切片在再次水合之后从其原有的盖玻片中滑脱。因为切片的高滑脱率，所以在风干切片上进行所有的测量，并探讨杨氏模量的横向值是否与志愿者的年龄无关。在来自所有7名志愿者的风干切片上进行以AFM为基础的纳米压痕技术，将杨氏模量的横向值标绘为志愿者年龄的函数。年轻人平均杨氏模量Ey = （8.11 ± 0.46） GPa，Nfibrils = 362；年长者平均杨氏模量为Eo = （4.19 ± 0.21） GPa，Nfibrils = 477；杨氏模量随年龄的增加而明显减小（P < 0.001）。老年志愿者中杨氏模量的变化也减小（σy2 = 65.77 GPa，σo2 = 17.56 GPa）。无论是年轻人组或是老年人组，各组内志愿者间杨氏模量值都无显著性差异。
glucosepane是胶原蛋白分子与葡萄糖（在体内发现的最高浓缩糖）相互作用而产生的最常见的AGE交联（在赖氨酸与精氨酸之间）。纳米机械测量的结果提示，纤维的水合作用可能出现变化，因此我们采取一种计算方法来研究glucosepane原子结构中有利的水合位点。Biemel等从早期分子动力学研究的最终框架中提取并提出了glucosepane的全原子结构。骨架原子被移除，由1个甲基终止2个脂肪链上的α-碳原子。该过程降低了计算成本，并且可以确保将1个显式水分子隔离到glucosepane混合物的极性结合区而不是多肽骨架。1个显式水分子被手动定位在距每个极性位点1.8 Å处。根据最终优化结构的可视化描绘，1个水分子被定位为咪唑基团中每个氮的电子受体，会形成Ⅰ和Ⅱ级结构；被定位为每个羟基的电子供体，会形成Ⅲ和Ⅳ级结构；被定位为每个羟基的电子受体，会形成Ⅴ和Ⅵ级结构。使用有6-311++g（2df，2p）基组的wb97xd函数对单水结合glucosepane水合物、未结合glucosepane和单水分子进行电子结构的优化，在隐式水溶剂中完成对超细集成网格的紧密融合。最佳结构和相对相互作用都能呈现出水与glucosepane之间一种稳定、积极的相互作用。使用aug-cc-pVDZ基组的MP2单点输入（SPE）计算和使用DFT频率计算的零点能量（ZPE）值进行校正可以补充DFT能量计算中的趋势。所有的ZPE值大约是308 kcal/mol。 电子供体分子与强极性基团之间的相互作用，如OH，通常会导致O-H键的长度改变，用Δd（O-H）来表示。此外，这些相互作用通常等同于1.3 ~ 2.3 Å的间距。Ⅰ级结构中水与氮的最佳配位导致0.019 31 Å的Δd（O-H）和1.883 5 Å的分子间距。根据Ⅱ级结构中水与对位氮的配位，可以观察到分子间距与Ⅰ级结构相比减少了0.108 6 Å，Δd（O-H）为0.029 03 Å。Ⅱ级结构中的羟基与赖氨酸氮之间较大的距离可以引起羟基氧上的电负性增加，因此提高了进一步的稳定性，根据DFT和ab初始计算法能量分别为1.403 1 kcal/mol和0.339 7 kcal/mol。  单水电子受体积极配位的最佳结构是距羟基1.797 7 Å，可以在Ⅲ级结构中观察到。尝试在第二个羟基的单一配位导致单水分子成为两个羟基供体的电子受体（见于Ⅳ级结构），这部分是由于一个羟基与相邻羟基的固有配位引起分子内非共价相互作用所致。在葡萄糖衍生物内已经发现相似的非共价分子内相互作用网。随着两个电子供体之间共享氧的电负性，分子间距增加至1.912 0 Å和1.947 5 Å。此外，相邻羟基经历了重要的O-H键延伸，Δd（O-H）分别仅为0.007 32 Å和0.007 08 Å。然而，成对的分子间配位产生了一个更加稳定的结构。 将水作为电子供体配位至羟基上的孤对导致Ⅵ级结构中的单分子间联系和Ⅴ级结构中的双分子间联系。结构显示，Δd（O-H）分别为0.004 03 Å、0.008 48 Å和0.010 22 Å。而且，每种结构都产生了指示稳定水结合的相对相互作用能。与Ⅵ级结构中水与glucosepane之间的单一联系相比，Ⅴ级结构属于一种稳定构象，根据DFT和ab初始计算法，其附加键可以导致相对相互作用能分别减少0.828 9 kcal/mol和0.177 8 kcal/mol。 该研究通过SEM和AFM成像技术发现的四级结构改变显示，胶原蛋白基质密度的降低和纤维均一性的缺失与年龄（自然老化）有关。年轻人与老年人真皮水合纤维的杨氏模量缺乏统计学差异，表明在完全水合的条件下，胶原蛋白的横向模量值不受年龄影响。然而，完全的再次水合是有可能与生理无关的。当胶原纤维呈水合饱和态时，会引起纤维直径增加。几乎没有证据表明体内会出现这种水饱和状态，因此必须慎重对待对完全水合纤维机械特性研究的结果。 该研究显示真皮胶原纤维呈放射状交错，不是沿纤维轴纵向排列。所获得的杨氏模量是纤维被压缩后间接测量其密度所得的横向模量。所以，年龄增加所导致的横向硬度降低与纤维密度的改变有关。所有的皮肤样本都是在空气中被动脱水的，以确保无纤维间质水存留。该研究者提出，胶原纤维的密度随年龄增长而降低的趋势与纤维内的水合程度有关。呈双峰分布且伴有低值尖峰的杨氏模量再加上较硬纤维的广泛分布表明，年轻志愿者有两种不同的纤维组织，即糖化纤维和非糖化纤维，而老年志愿者主要只有糖化纤维这一种。 随着自然老化的进展，蛋白聚糖中的HLA和GAG链会逐渐丢失，这会引起真皮持水能力显著减弱，极大改变ECM的机械特性。该研究证实，AGE交联的蓄积可能是机体应对真皮ECM持水能力减弱的一种反应。 该研究首次使用AFM对皮肤老化过程中胶原纤维结构的独特纳米级形态学差异进行辨认。此外，还首次观察到胶原纤维的横向硬度呈年龄依赖性减弱。一种推荐的水合机制通过电子结构计算得到验证，表明隐式溶剂中的单水分子缔合极为稳定，提示皮肤中胶原蛋白会根据真皮ECM中其他主要成分的变化而做出相应反应，从而维持其功能。  如前所述，在自然老化过程中，真皮的各个组分都要经历多种改变过程。该研究重点关注胶原纤维形态学上的改变和AGE蓄积产生的机械特性。然而，其他年龄相关的过程对该研究结果的影响目前尚不清楚。  ［陈旭 孔佩慧 摘自Ahmed T, Nash A, Clark KE, et al. Combining nano-physical and computational investigations to understand the nature of “aging” in dermal collagen. Int J Nanomedicine, 2017,12:3303-3314.］ 原研究单位：伦敦大学学院、欧莱雅法国研发和创新中心
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