【One week,One paper】|代谢组解析槲皮素在非酒精性脂肪肝中的影响机制

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研究背景

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，是一种获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝（SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH），这些疾病最终可能导致肝硬化以及肝癌。非酒精性脂肪肝已经成为全球性的疾病，严重威胁到人类的身体健康。造成脂肪肝的机制有很多，包括脂质过氧化、炎症因子损伤、氧化应激反应以及胰岛素耐受。脂质积累以及炎症已经被报道与非酒精性脂肪肝的形成有关，也有研究发现了多种化合物通过缓解炎症以及减少脂质的积累来减轻非酒精性脂肪肝，例如芹黄素、芸香苷。因此，寻找一种药物能够缓解炎症以及减少脂质的积累也可以成为治疗非酒精性脂肪肝的一种策略。

研究表明一些脂肪酸，例如棕榈酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸等在非酒精性脂肪肝中发生改变并促进脂质积累，而花生四烯酸则在非酒精性脂肪肝的发展进程中引起炎症。由于高糖高脂食物导致的非酒精性脂肪肝中，琥珀酸、柠檬酸的含量改变会导致三羧酸循环通路发生障碍，加重氧化应激反应，影响肝脏细胞线粒体的功能以及释放细胞激素，最终导致肝炎。而胆汁酸含量的改变在啮齿动物和人中与非酒精性脂肪肝均表现出相关。代谢组学是将多细胞生物体中病理学刺激或遗传性改变与代谢物联系起来的一种技术手段。目前，代谢组学已经被广泛应用在非酒精性脂肪肝药物的相关研究上，包括药效改进、新药开发以及药物机制研究。

槲皮素是一种丰富的食源性类黄酮，具有多种生理功能。槲皮素对于非酒精性脂肪肝中脂质积累以及炎症有治疗效果，能够减轻非酒精性脂肪肝带来的损伤。但是有关槲皮素是如何在这些代谢通路中发挥作用的还没有被诠释。因此，我们通过代谢组学来揭示槲皮素在非酒精性脂肪肝中治疗中发挥的作用。

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方法流程

• 物种：来自Sprague-Dawley重量180-220g、6周大的雄性小鼠

• 两种处理：

      ◆  处理时间：30天以及50天

      ◆  饮食处理：    

1. 对照组（C50）：基础饮食(360 kcal/100 g： 脂肪, 13.3 g/100 g；蛋白质,26.2 g/100 g；碳水化合物, 60.5 g/100 g)；
   

2. 模型组（M50）：高糖高脂饮食(506.8 kcal/100 g：猪油,10 g/100g； 胆固醇, 2g/100 g；蛋黄粉,5g/100 g； 糖,10g/100g；丙基硫氧嘧啶, 2g/100 g； 基础饮食,72.8 g/100 g)；
   

3.  槲皮素处理组（Q50）：高糖高脂饮食（同模型组）+槲皮素(50 mg/kg per day)

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研究结果

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代谢表型鉴定

为了研究槲皮素对于非酒精性脂肪肝的影响，首先对不同处理的小鼠血清中天冬氨酸（AST）以及丙氨酸(ALT)转移酶的含量进行鉴定，其次通过苏木精伊红对肝脏细胞进行染色来鉴定细胞的损伤程度，这种染色主要集中在由于高糖高脂饮食引起的肝液泡、脂滴、肝细胞肿大。结果表明模型组中血清中AST和ALT的含量明显高于对照组，并且处理50天的小鼠也明显高与30天的小鼠；而在槲皮素处理组中，AST和ALT的含量则明显低于模型组，但处理50天的小鼠其差异显著性低于处理30天的小鼠（图1B、C）。对肝细胞染色的鉴定中也表明同样的结果（图1A）。

图1.不同处理对于小鼠肝脏细胞以及AST、ALT的影响

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不同处理下代谢物的主成分分析

选取不同处理方法以及处理时间的小鼠血清进行HPLC-MS检测，检测到641个正离子对以及263个负离子对。通过筛选（p < 0.05, VIP > 1）得到277个正离子对、132个负离子对。进行主成分分析发现对照组与模型组中差异代谢物发生显著的分离，表明高糖高脂饮食对于小鼠血清中的代谢物会产生影响，并且处理50天的模型组与对照组的差异大于处理30天的模型组（图2A、B）。同时，处理30天的槲皮素处理组与模型组也产生了明显的分离，其与对照组的距离比50天处理的槲皮素处理组近，这一结果与代谢表型一致（图2C、D）。

图2. 不同处理下代谢物的主成分分析

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模型组与对照组差异代谢物分析 

将模型组与对照组进行差异代谢物分析，发现将差异代谢物参与的代谢通路可以粗略的分为4个方面：脂肪酸相关、炎症相关、氧化应激相关及其他。对每一个代谢通路中的代谢物进行主成分分析，分析结果表明脂肪酸在处理30天的分离明显优于50天，而其他3个代谢通路中处理50天的分离优于处理30天（图3A-H）。通过聚类热图对各个通路中的具体的代谢物进行分析，发现与脂肪酸通路相关的代谢物发生了下调，并且下调程度在处理30天中高于处理50天，而在其他3个代谢通路中物质上调和下调表达均出现（图3I）。总的来说，处理30天中代谢物集中在脂肪酸通路，而50天中集中在炎症通路。

图3.模型组与对照组差异代谢物分析

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筛选显著差异代谢物

联合槲皮素处理组、模型组以及对照组在4个代谢通路中差异代谢物进行主成分分析，结果表明槲皮素处理30天能够明显的恢复各个代谢通路（图4A、C）。为了进一步的寻找到能够缓解症状的潜在代谢物，在处理30天中检测到13个代谢物的相对含量发生了明显的变化（4B）。而在处理50天中只检测到3个代谢物发生了变化（图4D）。总的来说，槲皮素能够明显缓解处理30天中脂肪酸的通路，但是对于炎症通路的改善没有明显效果。

图4. 4个通路中的差异代谢物的主成分分析以及相对含量

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表型验证槲皮素的功能

通过检测血清中脂质、肝脏中脂质及肝脏炎症的程度进一步进行表型的检测来将代谢物与表型联系起来。结果表明，模型组与对照组相比，总甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白在血清中显著上升，高密度脂蛋白则显著下降。与模型组相比，槲皮素处理组中出现总甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白的下调，高密度脂蛋白的上调（图5A-D）。而通过对肝脏脂质进行染色的结果也表明在槲皮素处理后，脂肪的累积程度减轻（图5E）。对于炎症的表型进行鉴定也表明槲皮素在处理30天时能够减轻这种症状，但是在处理50天时已经不能进行有效的改善（图5F）。总的来说，槲皮素对于早期的治疗有明显的效果，但对于病程较久时没有很好的治疗效果。

图5.代谢物相关表型鉴定

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研究创新点

代谢组学作为新兴起的一个组学研究技术正在生物研究的各个领域发挥着越来越重要的作用。本研究将代谢组学与表型结合起来，揭示了代谢物与表型的相关性，为进一步研究非酒精性脂肪肝代谢物相关的通路提供了思路，为筛选新药物治疗非酒精性脂肪肝提供可能性。