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摘要 一百多年前Paul Ehrlich提出了人体免疫系统可以识别肿瘤细胞的假设，近年来免疫检查点抑制剂的发展，双特异性抗体以及经嵌合抗原受体修饰的T细胞的确加强了人体免疫系统的力量。CARsT治疗可以达到恶性血液病的完全缓解的疗效，然而它们同时也带来了严重的副反应甚至威胁生命，比如细胞因子风暴，肿瘤裂解综合征，或者对中枢神经系统产生致命的副作用，因此，紧急情况下CART细胞的关闭时必要的。靶向肿瘤相关抗原（TAAs）（这些抗原也表达在一些重要组织上），根据需求来灵活打开和关闭细胞来实现CART活性的反复切换，通过影像学跟踪治疗，治疗诊断学，模块化CARs诸如UniCAR系统可能有助于解决以上难题。 基于抗体人工受体基因修饰的T细胞的想法要追溯到上个世纪八十年代末，起初Z. Eshar 将这个想法称为体T细胞法，如今，被更好的称为嵌合抗体受体（CARs），CARs是合成的受体，结构上它们通常由（1）一个胞外抗体结构域，（2）一个跨膜结构域和（3）一个胞内信号结构域（如图1）构成。CART可以不依赖与细胞MHC的表达的方式独立识别肿瘤细胞。CARs的胞外区通常来自于单克隆抗体的重链和轻链的可变区(如图1)，通常由一个短的甘氨酸-丝氨酸连接而成的单链抗体片段融合表达，跨膜区域来自于CD28或CD8或者其他膜受体。CARs的胞内区包含一个信号结构域例如CD3ζ链或者DAP12链一样的激活受体。胞内信号基序来自于一个或多个共刺激基序，例如CD28 或4-1BB (CD137)或 ICOS o或OX40 (CD134) 或者它们的组合形式。依据信号基序的不同，CAR分为一代、二代、三代，或者根据布尔代数规则组合定位，信号传导和共刺激结构域可以分成两个独立的CARs. 经过将近三十多年的临床研究，CART最终被应用于临床。在恶性血液病患者身上取得的良好临床疗效，使得FDA最终批准了两款anti-CD19 CARs应用于复发难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。 不幸的是，当下的CART细胞治疗任处于实验治疗阶段，患者仍旧需要遭受严重的甚至威胁生命的副反应，像细胞因子风暴和裂解肿瘤综合征。另外，大多数肿瘤相关抗原(TAAs)不限于肿瘤细胞表达，导致了CART脱靶效应的风险。就像CD19不仅表达于白血病表面，健康B细胞表面也有表达，因此，靶向CD19的CART细胞治疗不仅清除了白血病细胞，同时也杀伤了健康B细胞。与其他大多数肿瘤相关抗原相比CD19是一个比较理想的CART靶标。因为部分B细胞的损失不是致命的，可以通过应用抗体治疗来克服。然而对于那些也表达在正常组织细胞表面的肿瘤相关抗原来说，这种拯救健康组织的功能是不可能的。 为了限制这种脱靶效应的毒性，已经提出了一系列策略被包括引入自杀基因，CRISPR/Cas9系统，或者靶向共表达的表面抗原。例如共表达一个剪切的EGFR抗体-西妥昔单抗。所有的这些防护措施用来消除、减弱CART细胞的毒副作用。然而，它们仍旧不能在紧急情况下迅速的关闭CART，例如PET成像分析表明，一个完整的抗体需要高达48小时才能富集在肿瘤区域。（如图2）而使用抗体60min后绝大多数抗体仍在外周血，只有少数抗体到达肿瘤区域。因此，使用完整的抗体实现快速关闭CART几乎不可能。另一个问题是，是否有足够数量的NK细胞存在于肿瘤微环境来来实现免疫抑制功能。同样的问题存在于用基因的方法来毁坏CART细胞。依据应对CRS和TLS病例中我们可以合理推测，快速切除CART基因能够足快速的阻止CART的毒副作用。所有的这些防护措施应用于避免长时间脱靶效应上显得有意义。的确，在实验鼠身上CD19 CART细胞可以被有效的清除，这就证明对CART细胞的清除是可行的。然而，问题的关键是找到合适的时间节点去清除。如果CART细胞被清除的太早，一些肿瘤细胞仍然存在，将导致疾病复发。如果处理的太迟，脱靶效应将会发生。不幸的是，目前影像技术在检测少量残留癌细胞方面还不够灵敏。如果影像学工具能够得到改善，那么剩余要回答的问题就是残留的肿瘤细胞是否通过降低自身表面抗原对CART耐受。因此，在影像追踪和治疗过程要合理的选择相同的靶分子。 如何解决当下CART 治疗的限制？对以上提出的种种分析最好有快速可行的开关来调节CART.(1)根据需求开关CART,（2）改变特异性来防止肿瘤突变时逃逸，（3）同时或者分步靶向多个肿瘤相关抗原来避免肿瘤突变时逃逸，（4）利用治疗诊断学工具实时追踪治疗，确认肿瘤逃逸突变体。 自然状态下，受体的功能受控于和配体的相互作用。直到2012年Urbanska et al 提出了有别与CART疗法的模块化人工受体策略。这一策略基于鸡的抗生物素蛋白作为CART的人工胞膜外受体结构域而不是TAA抗体结构域。这一思想的根本是人工抗生物素蛋白受体一直保持非激活状态直到靶细胞有生物素化的分子与抗生物素蛋白相互租用，例如生物素化的抗体。另外全长抗体受体武装化的CART,其生物学特性功能及其接近传统CARs。如上图2，血液中高浓度全长抗体需要数小时后才能富集在肿瘤区域。优先于富集在肿瘤区域，全长抗体可在机体血液中循环长达数周。因此，基于全长抗体的CAR,在细胞因子风暴爆发时，快速开关并不起作用，至少在没有连接子存在的情况下是这样的。另外，当肿瘤相关抗原TAA也表达于血细胞，内皮细胞时，CART细胞首先攻击这些细胞而不是肿瘤细胞。 2014年我们提出了模块化CAR系统，命名为UniCAR,(如图3)这就像给CAR的作用和副作用装上了一个方向盘。UniCAR系统基于先前描述的模块化双特异T细胞模式。与此同时类似与CAR的可控开关策略诞生了。UniCAR系统识别的抗原决定簇是生理学意义上的而不是识别任何易接近活细胞表面表位，无论肿瘤细胞还是健康细胞。因此，适应性转化UniCART细胞是惰性的，它的激活需要肿瘤细胞交联或者其它模块分子的结合。靶向模块分子必须融合表达针对TAAs和UniCART 细胞的CAR scFV识别的分子。因此UniCART 细胞的反复激活和关闭可以通过注射和停止注射模块化靶向分子来轻而易举的实现。为了快速把控UniCART，模块化靶向分子要能快速清除。就像之前展示的基于scFV或者纳米抗体的PET分析系统来实现这一夙愿。例如一些模块化靶向分子清除的半衰期是15到45分钟。尽管它们快速进入肿瘤细胞，由于未结合抗体造成的高背景，作为影像追踪似乎不太合适。然而，基于相同scFV重组抗体衍生物可以有效地延长它的半衰期而应用于PET影像追踪。另外，同样的衍生物分子可以同模块化靶向分子一样使用来加强疗效。利用短半衰期，长半衰期TMs的衍生物合理取代TMs,便于治疗，同时也能降低在治疗过程中产生的细胞影子风暴以及肿瘤裂解综合征的风险。以上TMs衍生物UniCAR重靶向，PET影像追踪无论从概念到实践，体内体外我们都做了论证。靶分子像CD19,CD123, CD33, PSCA, PSMA, GD2, EGFR, MUC1, STn 等。有趣的是TMs不仅限于抗体衍生物，一些小分子也可以实现TMs的功能。 针对La SS-B 选择性UniCAR的靶向抗原决定簇是核自身抗原，94-104氨基酸序列(SKPLPEVTDEY) 。它是La/SS-B 蛋白N端La基序和第一个RNP保守区域一段随机螺旋卷曲连接子。La蛋白发现于上世纪70年代早期，自此，我们和其他一些致力于自身免疫疾病研究的团队一直在研究它的结构，功能，表达，以及针对核自身蛋白La/SS-B的免疫应答。在这些研究中，未发现针对UniCAR抗原决定簇的反应。值得引起注意的是即使是自身免疫病的患者也能打破免疫对La/SS-B耐受，尽管不产生针对La/SS-B蛋白上那段UniCAR的靶向抗原决定簇氨基酸序列(SKPLPEVTDEY)的抗体，患者仍旧针对La/SS-B蛋白产生了免疫反应，而不是免疫耐受。甚至更糟的情况下UniCAR的靶向抗原决定簇触发了抗La自身免疫疾病，有报道称自身免疫反应随后表位扩散至其他抗La或核抗原抗La 抗体，对狼疮患者的抗DNA abs具有保护作用。另一个筛选La抗原决定簇的原因是La蛋白的一级结构在啮齿类动物进化过程中相当保守，所以UniCAR的毒副反应很容易在实验鼠身上观察分析得到。 总之针对困扰CART的安全技术问题，尤其是CART应用与实体瘤治疗方面或许可以通过模块化CAR,像UniCAR技术来得到解决。另外靶向模块化分子重靶向UniCAR可应用于影像学来追踪残存肿瘤细胞。 参考来源：Arndt C, Bachmann M, Bergmann R, Berndt N, Feldmann A, Koristka S.Theranostic CAR T cell Targeting, a brief review.J Labelled Comp Radiopharm. 2019 Mar 19. |
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