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作者：姜佳伟/鲁轩辕 来源：科研小助手 简介 此外，Nudt 7−/−小鼠表现出明显的脂质积累，这主要是因为过氧化物酶体功能障碍、IL-1β表达上调和诱导软骨细胞凋亡导致的。我们的基因组分析显示NUDT 7基因敲除会影响糖酵解途径，而且Pgam1是一个发生显著改变的基因。在软骨细胞中的过表达PGAM 1可诱导脂质的积累、IL-1β表达的上调和细胞凋亡，这与抑制NUDT 7得到的结果是一致的。 除此之外，当同时过表达NUDT 7后，PGAM 1负性调控软骨稳态的作用能够被逆转。我们的结果提示NUDT 7可能成为调控软骨退变相关疾病的潜在治疗靶点。 分解代谢途径调节因子激活可导致基质金属蛋白酶(MMPs)、崩解素（disintegrin）和含凝血酶素基序的金属蛋白酶(ADAMTS)的释放，最终导致软骨的破坏和软骨细胞凋亡。现阶段研究已经在OA发病过程中发现了许多导致分解代谢和合成代谢途径失衡的危险因素，但其关键的分子调节因子及其调控机制尚不清楚。 过氧化物酶体已知参与多种代谢途径，例如长链脂肪酸的β氧化、醚脂合成、胆汁酸代谢和活性氧代谢(ROS)。过氧化物酶体功能失调主要是由于过氧化物酶体的生物发生缺陷或过氧化物酶的缺陷所致。 核水解酶是一种过氧化物酶，具有从细胞中去除有毒核苷酸代谢产物和调节多种不同核苷酸底物、辅助性因子和信号分子浓度的功能。在核水解酶中，酶家族成员7（NUDT 7）是一种辅酶A(CoA)二磷酸酶，能够介导CoA的断裂。 NUDT 7能够消除潜在有毒的核苷酸代谢物，如过氧化物酶体中的β氧化产物，以及核苷酸二磷酸衍生物，如NAD+、NADH和核糖ADP。NUDT 7的细胞和生物学功能可能与OA发病密切相关，但NUDT 7与OA发病的关系尚未得到深入研究。本研究旨在探讨NUDT 7在OA发病中的作用及调控机制。 研究思路 一、NUDT7参与骨关节炎的病理过程 研究结果 2. 作者团队前期研究表明过氧化物酶功能失调参与OA病理形成过程并从数据库筛选出94个与OA病理形成相关的过氧化物酶基因。接着，作者从OA及Non-OA区域中提取软骨细胞，并检测上述94个基因的表达差异，发现NUDT7表达显著变化。进一步免疫组化染色发现NUDT7在OA中表达量下降，这些数据提示NUDT7可能参与调控骨关节炎的发生。 3. 为了探究NUDT7在骨关节炎发生中的具体作用，作者随即在软骨细胞中沉默NIDT7基因，发现沉默NUDT7后，软骨形成指标相关指标下降，软骨分解相关指标上升（Collagen C1-2C, Aggrecan Neoepitope， MMP 13等），同时，软骨细胞增殖减少，凋亡增加，过氧化物酶活性减低。(fig.1d-1i) 4. fig1中作者已在体外证明NUDT7能够参与调控骨关节炎发生。为了进一步研究NUDT7基因在体内的作用，作者构建了NUDT7-/-小鼠，并予DMM造模，同时分为给予正常饮食和高植醇饮食。 发现NUDT7-/- DMM造模组小鼠软骨退变更为严重，同时，高植醇饮食能加重软骨退变（fig.2a-2c）。（植醇是植酸的一种代谢产物，可通过通过调节脂肪酸代谢而影响过氧化物酶体功能。在喂食植醇的小鼠中，由于处于过氧化物酶体功能应激，OA表型更加明显。） 5. 接着，作者进一步探究NUDT7基因在软骨分化中的作用。作者从出生后5天的NUDT7-/-及NUDT7+/+小鼠中提取软骨细胞，培养5天后，进行细胞凋亡检测，软骨分解代谢相关基因检测以及过氧化物酶相关表达。发现与正常组比较，NUDT7-/-组软骨细胞分化能力减弱，细胞凋亡增加，ATP酶活性减弱，脂质含量增加，软骨分解代谢相关基因表达量上升。（fig.2d-2g） 小结：至此，作者已经分别在体内及体外证明，NUDT7能够调控骨关节炎的发生。那么，NUDT7是如何影响下游基因来进行调控的呢？作者进一步进行研究。 6.为了探究NUDT7下游调控的靶基因，作者从人OA软骨细胞及NUDT7-/-小鼠软骨细胞中提取RNA并进行了生信分析，发现糖酵解途径和游离脂肪酸代谢途径共存于OA软骨细胞、NUDT7-/-小鼠软骨细胞中。 通过生信分析，作者聚焦到PGAM1这个基因（PGAM 1是一种糖酵解酶，通过将3-磷酸甘油酸(3-PG)转变为2-磷酸甘油酸(2-PG)，将葡萄糖转化为丙酮酸.PGAM 1在多种生物反应中起着重要的作用，包括能量的产生和核苷酸的生物合成）（fig.3a）。随即，作者检测人OA标本中PGAM1的表达量，与对照组相比，OA软骨细胞、NUDT7-/-小鼠软骨细胞PGAM1的表达量增加最明显。（fig.3b-3d）。 7.作者同时也检测了KO小鼠中2-PG, acetyl-CoA, and malonyl-CoA的表达量，发现NUDT7-/-小鼠软骨细胞中这些指标较对照组增加，侧面佐证在OA软骨细胞中，PGAM1被激活。（fig.3e-3g） 8. 炎性细胞因子（如TNF-α,IL-6,IL-1β）表达上升是OA的一个重要特点之一。为此，作者检测了人OA区域软骨细胞及NUDT7-/-组软骨细胞中上述因子的表达量。发现与对照组相比，实验组上述炎症因子表达量上升，进一步验证了NUDT7参与调控骨关节炎的发生。（fig.4a-4c） 9. 接着，作者在软骨细胞中过表达PGAM1后，作者检测OA形成相关指标。发现与对照组相比，实验组细胞增殖能力减弱，凋亡增加，炎症因子表达增加，软骨分解代谢相关指标增加，软骨合成代谢相关指标较少。（fig.4d-4h） 10. 基因表达可以通过多种组蛋白修饰来控制，如甲基化和/或乙酰化。在这些组蛋白修饰中，histone 3 lysine specific trimethylation (如H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3, H3K36me3)可以调控基因表达。H3K4me3是一个基因表达激活的标志。H3K4me3已知能够与启动子结合，促进靶基因转录。 作者先检测了人膝关节软骨与各组小鼠膝关节中H3K4me3的表达量。发现与对照组相比，OA组与NUDT7-/-小鼠组关节软骨中H3K4me3表达量增加（fig5a-5c）。
11. 接着，作者采用染色质免疫共沉淀的技术检测H3K4me3与PGAM1启动子区域的直接结合作用。发现NUDT7组小鼠软骨细胞H3K4me3与PGAM1启动子区域结合增加。
12. 为了进一步研究NUDT7与PGAM1的相互作用，作者在NUDT7-/- 和NUDT7+/+小鼠关节中注射一系列慢病毒，检测各组小鼠骨关节炎发生情况。具体分组如下：1. NUDT7-/- +contorl；2. NUDT7-/- + shPGAM1；3. NUDT7+/++NUDT7;4. NUDT7+/++NUDT7+ PGAM1。发现:1.PGAM1沉默后，NUDT7-/-小鼠软骨退化情况减轻。2.过表达NUDT7能够挽救过表达PGAM1后所致的软骨退化。
13.同时，作者按照上述分组，在体外进行软骨退化相关实验，发现体外实验结果与体内结果一致。
结论 参考文献： Song J, Baek I J, Chun C H, et al. Dysregulation of the NUDT7-PGAM1 axis is responsible for chondrocyte death during osteoarthritis pathogenesis[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):3427.  |
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