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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 赖氨酸琥珀酰化(Ksucc)是一种进化上保守和广泛的翻译后修饰。组蛋白乙酰转移酶1 (Histone acetyltransferase 1, HAT1)是一种B型组蛋白乙酰转移酶，可调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化；然而，HAT1在琥珀酰化调节中的作用尚不清楚。在本篇文章中，我们采用定量蛋白质组学方法研究HepG2癌细胞中的琥珀酰化，发现HAT1可调节不同蛋白的赖氨酸琥珀酰化，包括组蛋白和非组蛋白。HAT1琥珀酰化K122上的组蛋白H3，参与肿瘤细胞的表观遗传调控和基因表达；此外，HAT1催化PGAM1在K99上的琥珀酰化，导致其酶活性增加，并刺激癌细胞中的糖酵解通量。临床上，HAT1在肝癌、胰腺癌、胆管癌组织中明显升高；在功能上，HAT1琥珀酰转移酶活性和由HAT1诱导的PGAM1琥珀酰化在体内外促进肿瘤进展中发挥关键作用，因此，我们认为HAT1是肿瘤发生过程中组蛋白和非组蛋白的琥珀酰转移酶。 论文ID 实验设计 实验结果 1. HAT1能够调节多种蛋白的琥珀酰化 Ksucc是一种像Kac一样广泛存在的PTM，这就增加了某些乙酰转移酶在靶蛋白上催化琥珀酰化的可能性。HAT1是一种乙酰转移酶，能够调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化。在本篇文章中，我们假设HAT1可能也能够调节琥珀酰化。为了回答这个问题，我们利用CRISPR/Cas9系统生成了敲除HAT1的HepG2细胞系。我们通过Western blot分析和Sanger测序从48个分离的克隆细胞中鉴定出HAT1在#3、#20和#34克隆细胞中缺失。为了证明我们的模型是有效的，我们在两个独立的克隆中重复了一些关键的分析，包括克隆#3和克隆#20，有时称为克隆#1和克隆#2。如果没有标记，则使用克隆#3(克隆#1)细胞进行实验。此外，我们试图通过细胞中泛抗Ksucc或泛抗Kac抗体的免疫印迹法来确定HAT1表达的改变是否会改变Ksucc的水平。与众所周知的HAT1对乙酰化的影响一致，我们发现，作为阳性对照，HAT1缺失后Kac水平下降。令人惊讶的是，HAT1的缺失显著降低了HepG2细胞中许多蛋白上的Ksucc水平(图1A和附录图S2A)，但并没有降低系统中琥珀酰辅酶A的水平(附录图S2B)，这表明HAT1可能调节多种蛋白的琥珀酰化，而且，敲除HAT1并不能影响细胞中其他酰化的水平，如丁基化、丁基化和丙酰化(附录图S2C)。 为了更好地了解HAT1介导的琥珀酰化在肿瘤细胞中的情况，我们通过用pananti-Ksucc抗体进行二甲基标记琥珀酰化富集并采用琥珀酰化定量蛋白质组学对野生型（WT）和HAT1敲除（KO）HepG2细胞中的Ksucc进行定量（附录图S3A和B）。更重要的是，我们的数据显示在204个蛋白中324个位点的Ksucc水平随着HAT1的缺失而下调；并且每个底物上的修饰位点和特定的基序不同，说明HAT1能够调节多个蛋白的琥珀酰化。表明HAT1能够调控多种蛋白质的琥珀酰化(图1B和C，附录图S3C和D )。有趣的是，我们发现HAT1靶向的琥珀酰化蛋白在亚细胞内广泛分布(图1D)。基因集富集分析(GSEA)，《京都市基因与基因组百科全书》(KEGG)和基因本体蛋白质域分析显示，靶向HAT1的琥珀酰化蛋白在一系列细胞过程中显示出重要作用(图1E和附录图S4)，因此，我们得出结论，HAT1能够调节多种蛋白质的琥珀酰化。 图1 HAT1能够调节多种蛋白的琥珀酰化 A，Western blot检测野生型(WT)和HAT1敲除(KO)克隆1中HepG2细胞的总细胞裂解液中Ksucc和Kac的水平(左)。B，对HepG2和HAT1基因敲除的HepG2细胞进行赖氨酸(K)琥珀酰化的定量蛋白质组学。C，火山图描述了WT与HAT1 KO细胞琥珀酰化定量蛋白质组学中Ksucc水平的相对折叠变化。D，在定量琥珀酰蛋白质组中发现的HAT1靶向琥珀酰化蛋白的细胞分布图。E，GSEA分析显示在琥珀酰化定量蛋白质组学中HAT1靶向的琥珀酰化蛋白的氧化过程。 2. HAT1是一种新型组蛋白琥珀酰转移酶 鉴于组蛋白修饰在表观遗传调控和染色质重塑中起关键作用，并广泛影响肿瘤发生过程中的基因表达，我们重点研究了HAT1对组蛋白琥珀酰化的调控作用。有趣的是，敲除的HAT1显著降低了HepG2细胞中组蛋白H3琥珀酰化水平，这比组蛋白H4琥珀酰化水平更明显(图2A和B，附录图S5A和B)。为了验证HAT1对组蛋白琥珀酰化的影响，我们建立了一个缺乏HAT1的胰腺癌PANC1细胞系和一个胆管癌HuCCT1细胞系。我们设计了3个靶向HAT1 mRNA的shRNA，其中shHAT1-3敲除效率最高，并在后续的PANC1和HuCCT1细胞实验中被使用(附录图S5C)。如我们所料，我们在细胞中观察到类似的结果(附录图S5D和E)，暗示HAT1可能参与了组蛋白H3琥珀酰化的调节。 基于HAT1与乙酰辅酶A结合并作为组蛋白乙酰转移酶，我们进一步测试了HAT1是否直接将琥珀酰辅酶A的琥珀酰基转移到组蛋白H3上。体外琥珀酰化实验表明，野生型His-HAT1，而非热灭活的His-HAT1，可以琥珀酰化组蛋白H3(图2C)，表明HAT1直接催化组蛋白H3的琥珀酰化。值得注意的是，高剂量辅酶A可以抑制HAT1介导的组蛋白H3琥珀酰化(图2D)，这表明辅酶A能够与琥珀酰辅酶A竞争结合HAT1，琥珀酰辅酶A中的辅酶A组参与了与HAT1的相互作用；然后，我们在体外研究了HAT1对组蛋白H3琥珀酰化和乙酰化的影响。有趣的是，我们观察到琥珀酰辅酶A显著抑制了HAT1介导的组蛋白H3乙酰化，但当将纯化的HAT1与纯化的组蛋白H3混合，同时存在等量的琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A时，乙酰辅酶A只会使HAT1介导的组蛋白H3琥珀酰化减少更小(图2E)，这表明乙酰辅酶A影响HAT1介导的组蛋白H3琥珀酰化。同时，体外酰化实验显示，HAT1直接催化组蛋白H3的琥珀酰化，而不催化组蛋白H3的丙酰化、丁基化和丁基化(附录图S5F)。 为了进一步验证HAT1对琥珀酰辅酶A的影响，我们利用Discovery Studio的生物信息学分析了HAT1与琥珀酰辅酶A的相互作用，用已知的HAT1乙酰辅酶A复合物的结构(蛋白数据库ID：2P0W)进行分子置换分析。有趣的是，我们发现HAT1的几个氨基酸残基参与了HAT1与琥珀酰辅酶A的相互作用，其中T188位点是最关键的位点之一(图2F和附录图S6A和B)。然后，我们测定了在无限底物浓度(Vmax)下酶催化反应的速度和琥珀酰辅酶A或乙酰辅酶A存在下HAT1修饰组蛋白H3的Michaelis常数。结果表明，HAT1对琥珀酰辅酶A的表达量低于对乙酰辅酶A的表达量(附录图S6C)；此外，HAT1琥珀酰化组蛋白H3的结合速度高于HAT1乙酰化组蛋白H3(附录图S6D)，说明HAT1与琥珀酰辅酶A的结合亲和力可能高于乙酰辅酶A。接下来，我们验证了相对于在内源性HAT1缺失的HepG2、PANC1和HuCCT1细胞中重组野生型HAT1的表达，HAT1(T188A)突变体的重组表达降低了组蛋白H3琥珀酰化，但没有降低组蛋白H3乙酰化(图2G以及附录图S6E和F)，表明HAT1上T188的位点对于HAT1介导的琥珀酰化至关重要。同时，HAT1基因敲除和HAT1 (T188A)突变均未影响细胞中组蛋白H3的丙酰化、丁基化和丁基化水平(附录图S6G)。综上所述，我们认为HAT1是一种新型组蛋白琥珀酰转移酶。 图2 HAT1是一种新型组蛋白琥珀酰转移酶 A，从HepG2 (WT)和HAT1敲除(KO)克隆#1 HepG2细胞中提取组蛋白。B，组蛋白H3从含或不含内源性HAT1的HepG2细胞中免疫沉淀(通过敲除)。C，通过混合纯化的HAT1、组蛋白H3和琥珀酰辅酶A，在体外琥珀酰化测定中测定HAT1催化的组蛋白H3琥珀酰化。D，通过混合纯化的HAT1、组蛋白H3和琥珀酰辅酶A (2 μM)，加入或不加入指定浓度的辅酶A，对HAT1催化的组蛋白H3琥珀酰化进行分析。E，HAT1介导的组蛋白H3琥珀酰化。F，HAT1与琥珀酰辅酶A结合的催化囊。G，组蛋白H3从用野生型HAT1或突变型HAT1（T188A）重构的HAT1 KO HepG2细胞中进行免疫沉淀。 3. HAT1催化组蛋白H3K122琥珀酰化进行表观遗传调控 接下来，我们详细研究了HAT1催化的组蛋白琥珀酰化位点。有趣的是，我们对5个组蛋白进行琥珀酰化定量蛋白质组学分析，发现了45个琥珀酰化位点，并首次鉴定出组蛋白H3的K36位点(附录图S7A)；进一步分析，我们列出了HAT1靶向的组蛋白琥珀酰化位点(附录图S7B)。有报道SIRT7作为去除剂，能够在K122位点催化组蛋白H3的脱琥珀酰化酶；然而，组蛋白H3K122琥珀酰化的writers尚未确定，因此，我们推测HAT1可能是组蛋白H3K122琥珀酰化的writer。如预期的那样，我们证实了在HepG2，PANC1和HuCCT1细胞中HAT1的缺失显着降低了组蛋白H3K122琥珀酰化和H3K27乙酰化的水平，但没有降低组蛋白H3K122乙酰化的水平，其中HAT1介导的组蛋白H3K27乙酰化被用作阳性对照(图3A和附录图S7C、D)。重要的是，在缺失内源性HAT1的细胞中，与重组野生型HAT1相比，那些重组表达未能影响组蛋白H3K27乙酰化的HAT1 (T188A)突变体，降低了组蛋白H3K122的琥珀酰化，但没有降低组蛋白H3K122乙酰化(图3A及附录图S7C、E)，这表明组蛋白H3K122的琥珀酰化需要HAT1。然后，我们在思考HAT1是否直接催化组蛋白H3在K122上的琥珀酰化。有趣的是，体外琥珀酰化实验显示，野生型His-HAT1，而非热灭活的His-HAT1，可以琥珀酰化组蛋白H3K122(图3B)，而突变型组蛋白H3 (K122R)不能琥珀酰化(图3B)。有趣的是，CoA可以在体外高剂量抑制HAT1介导的H3K122琥珀酰化(图3C)，表明HAT1可以直接催化H3K122的琥珀酰化。我们进一步观察到，琥珀酰辅酶A显著抑制了HAT1介导的组蛋白H3K27乙酰化；而将纯化的HAT1与纯化的组蛋白H3等量混合后，同时加入等量的琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A(附录图7F)，乙酰辅酶A只会使HAT1介导的组蛋白H3K122琥珀酰化的降低更小，说明乙酰辅酶A对HAT1介导的组蛋白H3K122琥珀酰化有中度影响。接下来，我们探讨了HAT1-介导的组蛋白H3K122琥珀酰化的功能，为了评估高分辨率组蛋白H3K122琥珀酰化的染色质占有率及其与HAT1的相关性，我们进行了染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析。令人惊讶的是，我们鉴定出145,499 H3K122琥珀酰化富集峰和1387个HAT1- binding-富集峰，其中609个峰在HepG2细胞基因组中普遍分布(附录图S7G)。在HepG2细胞的基因启动子区，H3K122琥珀酰化的ChIP-seq峰(2.95%，4292/ 145,499)和HAT1结合的ChIP-seq峰(4.48%，62/1387)被占据(附录图S7H和S8A)，表明HAT1介导的H3K122琥珀酰化可能是表观遗传调控和基因表达所必需的。正如预期的那样，我们验证了在代表性基因的启动子区中（包括CREBBP、BPTF和RPTOR），HAT1缺失显著降低了H3K122琥珀酰化；然而，与野生型HAT1在细胞中的重新表达相比，在耗尽内源性HAT1的细胞中重新表达HAT1 (T188A)突变体未能重建这种效应(图3D和附录Fig S9A和B)。一致的是，这些基因的mRNA水平被HAT1缺失所抑制。然而，在缺失内源性HAT1的细胞中，与重组野生型HAT1的表达相比，重组的HAT1 (T188A)突变体的表达未能恢复这种抑制(图3E和附录图S9C和D)，这支持了HAT1通过组蛋白H3K122的琥珀化作用来调节基因表达的观点。总之，我们得出结论，HAT1催化组蛋白H3K122琥珀酰化进行表观遗传调控和基因表达(图3F)。 图3 HAT1催化组蛋白H3K122琥珀酰化进行表观遗传调控 A，Western blot方法检测HepG2、克隆#1HepG2细胞，以及由HAT1基因敲除(KO)和突变型HAT1重组的HAT1 KO细胞(T188A)中组蛋白H3K122琥珀酰化、组蛋白H3K122乙酰化、组蛋白H3K27乙酰化、组蛋白H3、HAT1和β-actin水平。B，通过混合纯化的HAT1、组蛋白H3或组蛋白H3突变体(K122R)和琥珀酰辅酶A，对HAT1催化的组蛋白H3K122琥珀酰化进行体外琥珀酰化分析。C，通过混合纯化的HAT1、组蛋白H3和琥珀酰辅酶A (2μm)，加入或不加入指定浓度的辅酶A来分析HAT1催化的组蛋白H3K122琥珀酰化。D，HAT1对基因启动子处组蛋白H3K122琥珀酰化和组蛋白H3K122乙酰化的影响。E，采用RT qPCR方法检测HepG2细胞、HAT1 KO HepG2细胞和HAT1 KO HepG2细胞中CREBBP、BPTF和RPTOR mRNA的表达水平。F，一个阐明HAT1催化组蛋白H3K122琥珀酰化如何调节表观遗传调控和基因表达的模型。 4. HAT1特异性介导涉及糖酵解的非组蛋白琥珀酰化 除了组蛋白的琥珀酰化外，非组蛋白的琥珀酰化也被广泛发现，它影响各种细胞过程，如代谢途径。之前的研究报道SIRT5作为一个调节剂，调节赖氨酸去琥珀酰化，影响多种代谢途径；然而，到目前为止，关于非组蛋白琥珀酰化的writers还没有文献记载，因此，我们进一步探讨了HAT1对非组蛋白琥珀酰化的影响。我们对琥珀酰化定量蛋白质组学中鉴定的潜在的HAT1靶向非组蛋白进行了KEGG通路富集分析和相互作用分析。有趣的是，我们的数据显示，HAT1特异性介导了糖酵解相关蛋白的琥珀酰化，包括10种糖酵解关键酶中的7种，如GPI、TPI、GAPDH、PGK、PGAM、enolase和PKM(图4A-C和附录图S10)。此外，我们证实，在HepG2、PANC1和HuCCT1细胞中，消耗HAT1显著降低了葡萄糖消耗、乳酸生成的相对水平，以及许多与糖酵解相关关键代谢产物的胞内丰度，如丙酮酸、ATP和NADH (图4D-F，附录图 S11A-F)。有趣的是，在缺失内源性HAT1的细胞中，重组表达的HAT1 (T188A)突变体与重组表达的野生型HAT1相比也降低了这些标志物(图4D-F和附录图S11A-F)，表明HAT1介导的琥珀酰化促进了糖酵解，因此，我们得出结论，HAT1介导的非组蛋白琥珀酰化特异性靶向糖酵解。 5. HAT1琥珀酸酯PGAM1增强糖酵解 蛋白PTMs，如磷酸化和赖氨酸乙酰化，可以迅速调节关键糖酵解酶的活性，以响应急性营养信号。接下来，我们进一步研究了HAT1对糖酵解的调节是否由于糖酵解酶的琥珀酰化。首先，我们验证了HepG2，PANC1和HuCCT1细胞中HAT1的消耗抑制了PGAM1，ENO1和PKM的琥珀酰化，以及与重组野生型HAT1相比，在耗尽内源性HAT1的细胞中重新表达HAT1 (T188A)突变体未能挽救PGAM1、ENO1和PKM的琥珀酰化(图5A和附录图S12A-C)表明HAT1负责PGAM1，ENO1和PKM的琥珀酰化作用。然后，我们的数据表明，HAT1介导的琥珀酰化显着影响了HepG2细胞中三种酶中PGAM1的酶活性(附录图S12D)。因此，我们选择PGAM1进行进一步的研究，通过免疫沉淀验证了HAT1与PGAM1的相互作用(图5A和附录图S12A和B)；同时，我们在细胞中观察到PGAM1的乙酰化；但是，HAT1敲除和HAT1 (T188A)突变均未能影响细胞中PGAM1的乙酰化(附录图S12E)。此外，由于我们观察到HAT1可以催化组蛋白H3K122琥珀酰化进行表观遗传调控和基因表达(图3A)，我们开始探究PGAM1是否受到HAT1介导的组蛋白H3琥珀酰化转录调控，ChIP检测显示，细胞中PGAM1启动子上检测不到H3K122琥珀酰化和H3K122乙酰化(附录图S12F)。同样，敲除HAT1并重新表达HAT1 (T188A)突变体未能在细胞中调控PGAM1的mRNA表达(附录图S12G)，这表明HAT1在翻译后水平调控PGAM1的琥珀酰化，而不是在组蛋白H3K122琥珀酰化介导转录水平。消耗HAT1显著降低了细胞内PGAM1的相对活性和PGAM1直接调节的代谢产物2-PG的水平，增加了HepG2、PANC1和HuCCT1细胞中3-PG的水平(图5B和C，附录图S13A和B)；然而，在耗尽内源性HAT1的细胞中，与野生型HAT1的再表达相比，重新表达HAT1 (T188A)突变体未能恢复这一效果(图5B和C，以及附录图S13A和B)，表明HAT1通过琥珀酰化调节PGAM1的酶活性。 为了探讨HAT1是否直接催化PGAM1的琥珀酰化，我们进行了体外琥珀酰化实验。我们的数据显示，野生型His-HAT1能够琥珀酸化PGAM1，但不能乙酰化PGAM1(图5D)；同时，体外酰化实验显示，HAT1直接催化PGAM1的琥珀酰化，而不是PGAM1的丙酰化、丁基化和丁基化(附录图S13C-E)，而定量蛋白质组学研究表明，HAT1能够调控PGAM1在K99和K240上的琥珀酰化。更重要的是，我们发现当纯化的HAT1与纯化的PGAM1、PGAM1突变体(K99R)、PGAM1突变体(K240R)和PGAM1突变体(K99R/K240R)在琥珀酰辅酶A存在的情况下混合(附录图S13F)，相对于PGAM1突变体(K240R)， PGAM1突变体(K99R)的琥珀酰化显著降低，这一结果暗示PGAM1 K99是关键的琥珀酰化位点。体外PGAM1活性的结果与体外琥珀酰化实验的结果相似(图5E和附录图 S14A和B)，表明HAT1通过催化其琥珀酰化来调节PGAM1活性。在功能上，我们观察到PGAM1（K99R）突变体抑制了HepG2，PANC1和HuCCT1细胞的葡萄糖消耗，乳酸生成和2-PG水平，并提高了3-PG水平(图5F和附录图S14C-E)，暗示PGAM1的琥珀酰化可能有助于糖酵解。综上所述，我们得出结论，在肿瘤细胞中，HAT1通过调节PGAM1的琥珀酰化而不是乙酰化参与糖酵解。 图5 HAT1琥珀酸酯PGAM1增强糖酵解 A，PGAM1由HepG2、HAT1 KO克隆#1 HepG2和HAT1 KO克隆#1HepG2细胞 (由野生型HAT1或突变型HAT1 (T188A)重组)免疫沉淀。B，用PGAM1活性测定法测定肿瘤细胞中PGAM1的相对活性。C，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了由野生型HAT1或突变型HAT1 (T188A)重组的HepG2、HAT1 KO HepG2和HAT1 KO HepG2细胞中2-PG的减少和3-PG的增D，通过混合纯化的HAT1, PGAM1和琥珀酰辅酶A /乙酰辅酶A，在体外琥珀酰化测定中分析HAT1催化的PGAM1琥珀酰化。E，将纯化的HAT1、PGAM1或PGAM1突变体与琥珀酰辅酶A混合进行体外琥珀酰化测定，通过体外PGAM1活性测定测定相对PGAM1活性。F，用ELISA法分析了HepG2细胞内源性PGAM1缺失和PGAM1或PGAM1突变体(K99R)重组表达后，培养基中葡萄糖的减少、乳酸的增加以及2-PG和3-PG的相对含量。 6. HAT1介导的琥珀酰化在肿瘤生长中发挥关键作用 基于HAT1-介导的琥珀酰化在肿瘤细胞中的广泛影响和精确调控，我们进一步探讨了HAT1介导的琥珀酰化在肿瘤发生中的作用。首先，我们检查了HAT1表达的临床意义：免疫组化结果显示，HAT1在80.1%(186/232)临床肝癌组织、77.7%(98/126)临床胰腺癌组织、73.3%(88/120)临床胆管癌组织中均呈阳性(图6A)，表明HAT1在肿瘤中广泛表达；在功能上，MTS检测显示，消耗HAT1显著降低肝癌HepG2细胞、胰腺癌PANC1细胞和胆管癌HuCCT1细胞的增殖(图6B)；此外，在耗尽内源性HAT1的细胞中，再表达HAT1 (T188A)突变体未能恢复相对于重组表达野生型HAT1的效果(图6B)，暗示HAT1介导的琥珀酰化可能在体外促进肿瘤细胞的增殖；此外，MTS分析显示PGAM1的耗竭显着降低了上述细胞的增殖，与野生型PGAM1在耗竭的内源PGAM1的细胞中重组表达相比，PGAM1(K99R)突变体的重新表达未能挽救这种效应（图6C），暗示PGAM1的琥珀酰化可以增强体外肿瘤细胞的增殖，而裸鼠的致瘤性实验表明，HAT1的耗竭显着抑制了HepG2和PANC1细胞的生长，其中在肿瘤组织中Ki67的表达和H3K122的琥珀酰化以及糖酵解标志物的水平也降低了(图6D-H，附录图S15A-E)。重要的是，与在耗尽内源性HAT1的细胞中野生型HAT1的重组表达相比，HAT1(T188A)突变体HAT1的重组表达无法起作用(图6D-H，附录图S15A-E)，这表明HAT1介导的琥珀酰化可能在体内促进肿瘤生长中起关键作用；此外，裸鼠的致瘤性实验表明，与内源性PGAM1缺失的细胞中野生型PGAM1的重组表达相比，PGAM1(K99R)突变体的重组表达无法挽救PANC1细胞的生长(附录图S16A-E)，这表明PGAM1的琥珀酰化也可能促进胰腺癌的生长，因此，我们得出结论，HAT1介导的琥珀酰化是肿瘤生长所必需的。 图6 HAT1介导的琥珀酰化在肿瘤生长中发挥关键作用 A，采用免疫组织化学染色法检测肝癌、胰腺癌、胆管癌患者临床组织中的HAT1水平。B，采用MTS法检测HAT1介导的琥珀酰化对癌细胞增殖的影响。C，用MTS法检测PGAM1琥珀酰化对癌细胞增殖的影响。D-H，用野生型或突变型HAT1 (T188A)重组的HepG2细胞、HAT1 KO HepG2细胞和HAT1 KO HepG2细胞皮下注射入无胸腺裸鼠(N = 6)。 讨论 PTM是一种广泛而精确的调节机制，在细胞生理和病理过程中发挥着重要作用，赖氨酸的可逆性琥珀酰化已被确认，但其普遍程度和生物学功能在很大程度上尚不清楚，HAT1作为乙酰转移酶能够调控组蛋白和非组蛋白的乙酰化。我们前期的研究也证实了HAT1介导的组蛋白乙酰化调控乙型肝炎病毒共价封闭环状DNA微染色体的组装和表观遗传调控。在本研究中，我们试图确定在肿瘤发生过程中，HAT1在组蛋白和非组蛋白上的新琥珀酰化功能。 琥珀酰化是一种广泛存在的类似乙酰化的PTM。KAT2A是组蛋白H3琥珀酰转移酶，负责组蛋白H3K79琥珀酰化。本研究发现，HepG2细胞中HAT1的耗竭显著降低了包括组蛋白和非组蛋白在内的多种蛋白上的Ksucc水平；同时，敲除HAT1未能影响HepG2细胞中丙酰化、丁基化、巴豆化等其他酰化的水平，这暗示琥珀酰化可能是由HAT1调控的一种新的PTMs。为了更好地了解HAT1介导的琥珀酰化在肿瘤细胞中的作用，我们利用琥珀酰化定量蛋白质组学技术，结合泛抗Ksucc抗体免疫亲和富集和质谱分析，对野生型( WT )和敲除型(HAT1 KO) HepG2细胞中的Ksucc进行了定量。令人惊讶的是，我们的数据显示，消耗HAT1后，204个蛋白中324个位点的Ksucc水平被下调，每个底物和特定基序上的修饰位点数量不同，这表明，HAT1对于这些蛋白的琥珀酰化是必需的。此外，我们还发现，HAT1靶向的琥珀酰化蛋白在亚细胞内分布广泛，这表明HAT1介导的琥珀酰化可能参与多个细胞过程。以往研究者对琥珀酰化的研究主要集中在生理学功能方面，在本研究中，GSEA、KEGG、GO和蛋白结构域分析表明，HAT1靶向琥珀酰化在多条细胞通路中显著富集，这表明HAT1介导的琥珀酰化可能全局影响细胞的生理和病理过程。 组蛋白的PTM在表观遗传调控和染色质重塑中起重要作用，广泛影响基因表达。对于组蛋白的琥珀酰化，KAT2A是迄今为止唯一的组蛋白琥珀酰转移酶，负责组蛋白H3K79的琥珀酰化。在本研究中，我们发现HAT1能够催化组蛋白H3的琥珀酰化，这暗示HAT1是一种新型组蛋白H3琥珀酰转移酶。有报道称，SIRT7作为组蛋白去琥珀酸化酶，可以通过去除H3K122琥珀酸化基团来影响细胞内DNA损伤和基因组稳定性；然而，组蛋白H3K122琥珀酰基团转移酶的writers仍然未知。有趣的是，我们发现HAT1能够催化组蛋白H3K122琥珀酰化，从而促进肿瘤细胞的表观遗传调控和基因表达，如CREBBP、BPTF和RPTOR。这表明，HAT1是组蛋白琥珀酰化的一个新writer，并且HAT1介导的组蛋白琥珀酰化在癌症表观遗传学中具有广泛的意义，因此，我们对两个writers如KAT2A和HAT1在组蛋白琥珀酰化中的关系很感兴趣。但是我们发现KAT2A不能影响组蛋白H3K122的琥珀酰化，而HAT1也不能调节组蛋白H3K79的琥珀酰化，这表明，HAT1和KAT2A独立参与组蛋白琥珀酰化的调节。 除了组蛋白外，我们还鉴定了多种非组蛋白底物的琥珀酰化。对于非组蛋白的琥珀酰化，在非组蛋白的琥珀酰化反应中，去酰化酶或去琥珀酰化酶的鉴定近年来取得了显著进展；然而，关于琥珀酰基转移酶(writer)用于非组蛋白的研究还没有定论。值得注意的是，在组蛋白和非组蛋白上催化琥珀酰化的琥珀酰转移酶目前还没有发现。有趣的是，在本研究中，我们发现HAT1特异性介导涉及糖酵解的非组蛋白琥珀酰化，这表明，HAT1介导的琥珀酰化可能有助于糖酵解。在功能上，我们的数据表明，HAT1介导的琥珀酰化促进糖酵解，我们发现在肿瘤细胞中，HAT1是通过PGAM1的琥珀酰化进行糖酵解所必需的，而不是其乙酰化，这表明，在肿瘤发生过程中，HAT1介导的PGAM1琥珀酰化对糖酵解至关重要。 目前有关琥珀酰化的研究还停留在早期阶段，有关琥珀酰化在疾病尤其是肿瘤中的作用尚不清楚。有报道称，KAT2A可通过调节组蛋白H3K79琥珀酰化促进神经胶质瘤细胞的肿瘤生长。鉴于HAT1介导的琥珀酰化在表观遗传调控和糖酵解中的重要作用，我们对HAT1介导的琥珀酰化在肿瘤发生中的作用进行了研究。临床免疫组化显示，HAT1在肝癌组织、胰腺癌组织、胆管癌组织中表达明显升高，这暗示HAT1可能在肿瘤中发挥重要作用。接下来，我们将进一步探讨HAT1介导的琥珀酰化在体内外的功能。我们的数据表明，HAT1介导的琥珀酰化是肿瘤生长所必需的，包括肝癌和胰腺癌，由此，我们推断HAT1在肿瘤发生过程中对琥珀酰化的调控中发挥了新的作用。我们的发现为组蛋白乙酰转移酶HAT1在癌症进展中调节琥珀酰化的机制提供了新的见解。 结论 总之，我们总结了一个HAT1在肿瘤发生中的琥珀酰化功能模型(附录图S17)。HAT1影响包括组蛋白和非组蛋白在内多种蛋白的Ksucc水平，参与多种细胞生理和病理通路。对于组蛋白而言，HAT1是一种新型组蛋白琥珀酰转移酶，通过催化组蛋白H3K122琥珀酰化，增强表观遗传调控和基因表达谱；对于非组蛋白，HAT1在癌细胞中通过催化PGAM1在K99上的琥珀酰化来促进糖酵解；在功能上，HAT1介导的琥珀酰化对肿瘤的发生至关重要。 |
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