基于斑马鱼M-Act/Tox联合评价箭叶淫羊藿的代谢-效/毒作用

鱼中毒（脏器变形或死亡），毒性与给药质量浓度和时间相关；经斑马鱼作用后，EA、EB、EC及淫羊藿苷几近全部转化，代谢物以SC与BI为主；箭叶淫羊藿在一定质量浓度（6.25、12.5、25 μg/mL）具显著的抗泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失作用。

壮骨中药治疗骨质疏松症疗效确切受到青睐，但其副作用正日益受到关注^[1-4]，这为临床安全、合理用药带来极大挑战。兼顾有效性与安全性的快速评价与安全预警具有重要意义，中药的效应（action，Act）/毒性（toxicity，Tox）产生与其代谢转化（metabolism，M）密切相关，全面考虑代谢-效/毒（M-Act/Tox）联合的筛选具有意义^[5]。

针对现有体内、外模型无法进行M-Act/Tox联合的在体、高效筛选的技术瓶颈，本课题组依据斑马鱼的遗传发育与哺乳动物高度相似的特点及优势^[6]，参考前期相关研究及国内外文献，提出斑马鱼代谢模型^[7]、骨质疏松模型^[8-9]及毒性评价法^[10-12]有机整合，可建立M-Act/Tox联合的抗骨质疏松中药高效筛选法。对实现兼顾有效性与安全性，实现条件简单、高效率、低成本、高灵敏地进行中药在体M-Act/Tox联合评价具有重要意义^[5]。

淫羊藿为壮骨关节丸和仙灵骨葆制剂的君药，其肝损伤风险受到重视。箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb. etZucc.) Maxim. 是小檗科淫羊藿属植物的干燥叶，是淫羊藿的基原植物之一，为传统补益类中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效^[13]，其抗骨质疏松活性受到广泛关注，活性相关的代表性黄酮成分主要有朝藿定A（EA）、朝藿定B（EB）、朝藿定C（EC）、箭藿苷C（SC）、宝藿苷I（BI）、淫羊藿苷等，具有抗骨质疏松等作用，其他成分还有淫羊藿新苷C、淫羊藿新苷D、淫羊藿新苷E、箭叶淫羊藿素E等^[14]。箭叶淫羊藿的安全性及黄酮组分的代谢特点尚缺乏相关研究。本研究采用提出的斑马鱼M-Act/Tox联合法，评价箭叶淫羊藿的安全性、抗效物质基础提供参考。

1  材料

1.1  实验动物

斑马鱼成鱼（南京大学模式动物研究所），来自德国Tuebingen品系。

1.2  药品与试剂

箭叶淫羊藿药材由贵州同济堂制药有限公司提供，经江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药释药系统重点研究室韦英杰研究员鉴定为箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb. etZucc.) Maxim.；EA（质量分数98%，批号JZ16042502）、EB（质量分数98%，批号JZ15110905）、EC（质量分数98%，批号JZ16042503）、SC（质量分数98%，批号JZ16071606）、BI（质量分数98%，批号JZ15070602），购自南京景竹生物科技有限公司；淫羊藿苷（质量分数98%，批号110737-200415），购自中国食品药品检定研究院；培养基母液：0.29% NaCl、0.012 58% KCl、0.048 51% CaCl₂·2H₂O、0.081 18% MgSO₄·7H₂O；依替磷酸二钠（上海源叶生物科技有限公司，批号20180412）；泼尼松龙（质量分数98%，批号FD050193，萨斯化学技术上海有限公司）；多聚甲醛（成都市科龙化工试剂厂，批号20140901）；MS-222（比利时Acros Organics公司，批号A0288328）。

1.3  仪器

2  方法

2.1  箭叶淫羊藿中代表性黄酮成分HPLC分析

2.1.1  色谱条件  色谱柱为Agilent Zorbax C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）和C₁₈预柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～10 min，10%～23% B；10～35 min，23%～26% B；35～65 min，26%～48% B；65～80 min，48%～80% B；80～85 min，80%～100% B；85～90 min，100% B；柱温25 ℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长270 nm；运行时间90 min；进样量20 μL。分析箭叶淫羊藿50%乙醇提取物经斑马鱼作用前后的6个代表黄酮成分，分别为EA、EB、EC、淫羊藿苷、SC、BI。

2.1.2  混合对照品的制备及线性关系考察  分别精密称取适量对照品淫羊藿苷、EA、EB、EC、SC和BI，用甲醇溶解分别配制成135.3、167.8、80.9、164.6、198.2、102.9 µg/mL，再分别吸取适量混合，甲醇定容，配制成混合对照品，质量浓度分别为9.02、11.18、10.78、10.97、7.93、6.86 µg/mL。将上述混合对照品溶液依次倍比稀释，得到系列质量浓度的混合对照品溶液，按照“2.1.1”项条件进样测定。以峰面积值为纵坐标（Y），以对照品质量浓度为横坐标（X），进行线性回归，得到回归方程及线性范围：EA，Y＝12.084 X－2.201（r＝0.999 8），线性范围7.93～126.85 µg/mL；EB，Y＝10.748 X－4.328（r＝0.999 9），线性范围18.53～296.44 µg/mL；EC，Y＝14.328 X－9.431（r＝0.999 9），线性范围13.75～220.00 µg/mL；SC，Y＝16.925 X－2.549（r＝0.999 9），线性范围4.30～68.80 µg/mL；BI，Y＝0.457 2（r＝0.999 9），线性范围3.288～350.700 µg/mL（进样20 µL）^[16]。

2.2  斑马鱼模型评价箭叶淫羊藿的安全性

2.2.1  供试液配制  称取适当粉碎的箭叶淫羊藿10 g，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，取相当于10 mg箭叶淫羊藿的提取液，吹干，加培养基10 mL溶解，即得母液（生药1 mg/mL）。取母液适量，用斑马鱼培养基配制成生药质量浓度分别为200、500、1 000、1 500、2 000 μg/mL的供试药液，供斑马鱼毒性研究用。

2.2.2  斑马鱼给药  胚胎由斑马鱼成鱼自然交配产生，将胚胎放置高纯水中在28 ℃培养箱中培养24 h。取受精后1 d（1 dpf）斑马鱼胚胎，置24孔板中，每孔8个胚胎，每组16个胚胎，分别暴露于不同质量浓度的供试液中，每孔2.0 mL溶液，用培养基为对照组。每天计数幼鱼死亡数量，显微观察幼鱼的行态/形态，并于3 dpf时拍照，一直记录到6 dpf。

2.2.3  数据分析 利用数据统计软件SPSS 16.0计算2～6 dpf的斑马鱼半数死亡浓度（LC₅₀）。

2.3  斑马鱼模型评价箭叶淫羊藿的体外代谢

2.3.1  斑马鱼幼鱼24 h体外代谢给药与取样方法  取斑马鱼幼鱼（5 dpf），分别置于6孔板中，每孔30条，每组2孔。加入生药质量浓度为250 μg/mL的箭叶淫羊藿供试液，每孔加药液3 mL；未加鱼的剩余药液为空白药物组。药物组于斑马鱼幼鱼暴露溶液后24 h（即6 dpf），吸净每孔药液，共6 mL；空白药物亦于24 h吸取6 mL，于−70 ℃冰箱放置。

2.3.2  样品处理  将代谢药液、空白药物各6 mL，空气室温吹干，残渣加80%甲醇0.5 mL溶解，15 000 r/min离心10 min，上清进样20 μL进行HPLC分析。

2.4  斑马鱼模型评价箭叶淫羊藿抗骨质疏松活性

2.4.1  药物溶液的配制 

（1）泼尼松龙溶液配制：精密称取泼尼松龙9 mg，加入DMSO 1 mL，混匀即得25 mmol/L泼尼松龙储备液，取泼尼松龙储备液10 μL，用培养基稀释并定容至10 mL，即得。

（2）含25 μmol/L泼尼松龙的30 μg/mL依替膦酸二钠溶液配制：精密称取依替膦酸二钠6 mg，加入1 mL培养基混匀，即得6 mg/mL依替膦酸二钠储备液。取6 mg/mL依替膦酸二钠储备液50 μL和25 mmol/L泼尼松龙储备液10 μL，用培养基稀释并定容至10 mL，即得。

（3）箭叶淫羊藿供试液配制：分别取箭叶淫羊藿（生药500 μg/mL）供试液和25 mmol/L泼尼松龙储备液适量，配制成含25 μmol/L泼尼松龙的箭叶淫羊藿（生药6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）溶液，供斑马鱼药效实验研究。

2.4.2  斑马鱼分组与给药方法  将3 dpf的斑马鱼胚胎放入24孔板中，每孔8个胚胎，每组16个胚胎，实验分组为0.4% DMSO溶媒对照组、模型组（25 μmol/L泼尼松龙）、阳性药物组（30 μg/mL依替膦酸二钠）、箭叶淫羊藿各质量浓度供试液组，每孔加入药液2 mL。将24孔板放入28.5 ℃恒温培养箱中培养。培养周期5 d，隔天换1 mL新溶液，培养至8 dpf。

2.4.3  斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析方法  斑马鱼幼鱼培养至8 dpf，用4%多聚甲醛处死固定过夜后，采用1% KOH配制含1.5% H₂O₂漂白剂，将鱼体漂白后，采用茜素红对斑马鱼幼鱼头部骨骼染色，最后用1∶1的1% KOH和甘油的透明液透明，去除多余的染色剂。用专业的图像分析软件Image pro plus 6.0计算头部骨骼染色面积和累积吸光度值。

2.4.4  数据分析 用Excel软件统计分析头部骨骼染色面积和累积吸光度值数据，计算各组数据的平均值、标准偏差以及变异系数（n＝5～6），组间比较采用t检验。

3  结果

3.1  箭叶淫羊藿的安全性评价

3.1.1  显微镜观察结果  3 dpf时胚胎孵化成幼鱼，各脏器发育基本完全，鱼体透明，在载玻片上易侧卧，显微镜下检视脏器形态清楚、直观。本实验观察到箭叶淫羊藿对斑马鱼的毒性基本呈时间和浓度依赖性。对3 dpf斑马鱼胚胎及幼鱼进行动态检视，并拍照。与对照组比较，箭叶淫羊藿200 μg/mL组部分幼鱼（3 dpf）卵黄囊略肿大，500 μg/mL组幼鱼（3 dpf）卵黄囊明显肿大，头颈弯曲，眼睛变小，呈明显中毒表现。结果见图1。

3.1.2  死亡率结果  箭叶淫羊藿致斑马鱼的死亡数量与给药质量浓度和时间基本呈依赖性，其给药时间-剂量-死亡率关系见图2。箭叶淫羊藿各质量浓度组中，给药后24 h，2 000 μg/mL组斑马鱼幼鱼全部死亡；给药后48 h，1 000、1 500 μg/mL组斑马鱼幼鱼也全部死亡，500 μg/mL组50%的斑马鱼幼鱼（3 dpf）死亡；给药72 h，500 μg/mL组斑马鱼幼鱼全部死亡，给药96、120 h，200 μg/mL组25%的斑马鱼幼鱼（5、6 dpf）死亡。

3.1.3  箭叶淫羊藿的LC₅₀  用统计学软件SPSS 16.0计算出箭叶淫羊藿给药后1～5 d（2～6 dpf）的LC₅₀（图3）。从图中可以看出，在斑马鱼2 dpf时LC₅₀值最高（1 247.0 μg/mL），随着给药时间的延长，LC₅₀值逐渐降低，提示毒性渐增，在5～6 dpf时LC₅₀趋向稳定（260.4 μg/mL）。

3.2  箭叶淫羊藿体外代谢的评价

箭叶淫羊藿作用斑马鱼24 h前后的HPLC图见图4。以外标法计算6个主要淫羊藿黄酮成分质量分数，并以每个成分占6个黄酮成分总质量分数的百分比计为相对百分含量，结果见图5。结果发现经斑马鱼代谢前EA、EB、EC、淫羊藿苷、SC和BI的相对百分含量分别为25.6%、1.0%、8.5%、9.2%、26.9%、28.7%，代谢后多糖苷EA、EB、EC和淫羊藿苷几乎全部转化成SC与BI，二者的相对百分含量分别为17.8%、79.8%，占代谢物的97.6%。

3.3  箭叶淫羊藿抗骨质疏松活性评价

各组斑马鱼幼鱼（8 dpf）头骨茜素红染色的显微成像结果见图6，图像分析软件分析结果见图7。与对照组相比，模型组的骨染色矿化面积和累积吸光度值明显降低，差异显著（P＜0.05、0.01），表明泼尼松龙25 μmol/L能够成功诱导斑马鱼骨量减少；与模型组比较，依替膦酸二钠30 μg/mL组矿化面积和累积吸光度值显著升高（P＜0.01）。箭叶淫羊藿6.25、12.5、25 μg/mL组斑马鱼头骨矿化面积和累积吸光度值较模型组显著增加（P＜0.05、0.001），但随着箭叶淫羊藿质量浓度进一步提高到100、200 μg/mL时，斑马鱼的头骨矿化面积和累积吸光度值却呈下降趋势。

4  讨论

药物的效应/毒性产生与其在体内的代谢转化密切相关。斑马鱼幼鱼体小、透明，发育快速，于3 dpf时孵化成幼鱼，至5 dpf各种脏器基本发育完全，具有较完善的代谢酶系和肠道菌群，于8～9 dpf时头骨基本发育完全。可见，本实验选择1～8 dpf斑马鱼可在微板中进行M-Act/Tox联合评价。

近年来淫羊藿的潜在毒性风险受到重视，其抗骨质疏松主要活性成分黄酮的安全性及代谢至关重要。

斑马鱼毒性评价发现，箭叶淫羊藿在500 μg/mL及以上质量浓度时致斑马鱼中毒（脏器变形或死亡），毒性与给药质量浓度和时间相关。泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型评价发现，低质量浓度箭叶淫羊藿（6.25、12.50、25.00 μg/mL）具有明显的抗泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失作用，而在较高质量浓度（100、200 μg/mL）时抗骨质疏松作用则受到抑制，这为安全、有效地使用淫羊藿提供参考。斑马鱼代谢实验发现，箭叶淫羊藿中主要多糖基黄酮成分EA、EB、EC和淫羊藿苷经斑马鱼作用24 h后，全部脱糖基转化为含有2个鼠李糖基的SC和1个鼠李糖基的BI，而SC和BI相对稳定，提示代谢物可能是潜在致毒/致效的关键因素，在前期研究中发现多糖苷EA、EB和淫羊藿苷对斑马鱼的毒性小，以淫羊藿苷为代表，发现其给予斑马鱼后动态转化为BI，但未见斑马鱼产生毒性；而EC给予斑马鱼后，动态转化为箭藿苷C后毒性增加^[6]。本研究亦提示斑马鱼的效应/毒性评价是基于代谢转化的在体过程。

斑马鱼M-Act/Tox联合评价法突破了现有体内、外模型无法兼顾三者在体与高效评价的技术瓶颈，具有样品用量小、劳动强度小、高效率、低成本、在体化、微板化等优点，为高效辩识壮骨中药的M-Act/Tox提供思路与方法。

参考文献（略） 

来  源：葛  静，凌  洁，宁  青，刘欣欣，宋  捷，韦英杰，贾晓斌. 基于斑马鱼M-Act/Tox联合评价箭叶淫羊藿的代谢-效/毒作用 [J]. 中草药, 2019, 50(7):1614-1620.