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编写：WB小能手 lncRNA芯片分析的基本步骤 1. 归一化lncRNA芯片采用的归一化的方法为quantile normalization。 2. 差异LncRNA的筛选lncRNA芯片中既有lncRNA的探针又有mRNA的探针，分别做差异基因的筛选，筛选方法同表达谱的筛选方法是一致的，参见表达谱的差异基因筛选。 3. 差异lncRNA的重注释lncRNA芯片注释不完善，因此需要将筛选出来的lncRNA进行重注释。将差异lncRNA在基因组上位置上下游延伸，以寻找lncRNA附近的有功能的基因。 4. 差异lncRNA靶基因的预测lncRNA可能通过调控相应的mRNA发挥功能，因此有必要预测lncRNA的靶基因。我们提取差异lncRNA和mRNA的序列，首先用blast进行初筛，之后用RNAplex进行进一步筛选，以预测lncRNA可能调控的mRNA。 5. 差异lncRNA与靶基因共表达网络预测出lncRNA的靶基因后，并可进一步在mRNA的数据中探寻该mRNA是否发生表达量的变化。由此构建差异lncRNA与靶基因相互作用网络图。 6. 差异lncRNA与差异mRNA的共表达分析SBC Human lncRNA芯片能同时检测出差异表达的lncRNA和mRNA。我们将差异lncRNA和差异mRNA在一组样品中进行共表达分析，可以发现与某个lncRNA具有相同表达模式的mRNA。 样本数据要求：每组数据3个或3个以上生物学重复 实验组：对照组： 7. 差异lncRNA靶基因的GO analysis对lncRNA的靶基因进行GO Ontology的生物学的分类，根据Fisher's Exact Test,得到p-value，得到lncRNA靶基因对应的显著性功能，从而了解lncRNA的功能。 8. 差异lncRNA靶基因的pathway analysis对lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共数据库KEGG和Biocarta来进行分类，对Pathway中的基因进行基于离散分布的显著性分析，得到与实验目的有显著联系的Pathway 分类,由这些pathway对应相应的靶基因，从而获得该分类即导致lncRNA差异的最重要Pathway。 9. 差异lncRNA的转录因子的预测提取lncRNA TSS的上游2000bp，下游500bp,利用HMM的算法根据TRANSFAC8.1数据库预测其转录因子。 10. lncRNA cis作用机制研究：对于感兴趣的差异表达lncRNAs，搜索其上下游100K范围内的所有编码基因，并与该lncRNAs 有显著共表达的基因取交集。这些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因很可能被该lncRNAs 所调控。 11. lncRNA trans作用机制研究：计算LncRNAs 共表达的编码基因，集合与转录因子/染色质调控复合物的靶基因集合的交集，利用超几何分布计算该交集的富集程度，得到与lncRNAs 显著相关的转录因子，从而识别可能与lncRNAs 联合发挥调控作用的转录因子/染色质调控因子。 ---------介绍--------- 长链非编码RNA（lncRNA） lncRNA长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类不编码蛋白的RNA 分子，长度在200bp 以上，起初被认为是RNA 聚合酶II 转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA 具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA 和RNA 相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA 的诱导分子干扰基因的表达等。 随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA 被注释，但是绝大多数的lncRNA 的功能仍然不清楚，因此lncRNA 的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。 为何细胞不惜耗费能量对这些非编码RNA的表达和定位进行严格调控呢？这些RNA分析究竟有何功能？RNA测序技术的发展使人们得以初窥这一神秘分子，现在lncRNA的许多相关信息都可以再新数据库中查到，例如Broad研究所、哈佛大学和麻省理工共同开发的Human Body Map lincRNAs catalog。虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是现在人们了解到的lncRNA只是冰山一角，绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。随着研究的推进，各类lncRNA的大量发现，lncRNA的研究作为RNA研究的新领域，已经成为一个非常吸引人的方向，有待广大科学家去探寻。lncRNA研究当前面临的一个主要挑战是，研究工具还在不断开发和改进中，而lncRNA研究中非常关键的一步就是发现与特定疾病相关的lncRNA。现阶段，基因芯片技术发展趋于成熟稳定，在此平台上，通过设计不同检测lncRNA探针筛选lncRNA是一种准确快捷的方法。lncRNA特征lncRNA通常较长，具有mRNA样结构，有些具有poly(A)尾巴，有些没有poly(A)尾巴，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式，与编码基因相比，lncRNA表达量更低。 ※ 组织特异性：不同组织之间的lncRNA表达量不同。 ※ 时空特异性：同一组织或器官的不同生长阶段，其中的lncRNA表达量也会变化。 ※ lncRNA启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4，Nanog，CREB，Sp1，c-myc，Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征。 ※ 大多数的lncRNA在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性，如有人针对小鼠的1300个lncRNA进行研究，发现在脑组织中的不同部位，lncRNA具有不同的表达模式。※ 在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式。 ※ lncRNA的亚细胞位置上也呈多样化，在细胞核、细胞质和细胞器均有分布，甚至某些lncRNA具有独特的亚细胞位置，有可能是全新的亚细胞构成。 lncRNA功能 lncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控：a) lncRNA通过招募染色质重塑复合物至特定的基因组位点使其发生催化活性。如HOTAIR21，Xist、RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位点，使得X染色体或Kcnq1功能域的组蛋白H3 第27位赖氨酸发生3甲基化（me3K27），诱导异染色质形成，从而抑制该区域基因表达。b) lncRNA通过多种机制进行转录水平调控。lncRNA结合到基因cyclin D1上，招募RNA结合蛋白TLS来调控蛋白CBP和p300的组蛋白乙酰转移酶活性，进而抑制cyclin D1转录。c) 超保守增强子转录出lncRNA-Evf2，该lncRNA能激活转录因子DLX2，进而调控基因Dlx6转录。d) DHFR次要启动子区域转录出的lncRNA与该基因主要启动子区域结合形成三聚体，抑制转录因子TFIID结合，从而使基因DHFR发生沉默。e) 反义lncRNA能够与剪接体（splicesome）中锌指同源mRNA Zeb2的5'剪切位点结合，使内含子未被剪切掉，而该内含子序列中保留有内部核糖体进入位点（IRE位点），翻译过程中识别并结合该位点，导致Zeb2基因表达和翻译。 lncRNA分子机制随着lncRNA功能逐步显现，其与靶点的作用机制成为进一步的热点。 早期认为原位调控是LncRNA作用的唯一机制，它通过招募形成染色质修饰复合物而沉默邻近基因转录，例如IGF2R反义RNA(antisense of IGF2RRNA，AIR)、XIST等。而Hox基因反义基因间RNA(Hox antisense intergenic RNA，HOTAIR)的发现提示LncRNA可能存在远程调控。同源异型基因(homeotic genes，HOX)在细胞增殖与定向分化中起关键作用，人类Hox基因簇约含100个ncRNA基因，其中HOTAIR定位于HOXC基因座12q13.13。HOTAIR的5'端可招募结合多梳蛋白抑制复合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)，借助PRC2上三个H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED，使另一基因座HOXD上长约40kb的序列转录沉默，从而在乳腺上皮细胞内使细胞内转录倾向于胚胎成纤维细胞样表型。超过20%的LncRNA能够通过结合PRC2或其他类似复合物发挥作用，提示LncRNA的远程调控机制在生物体内广泛存在。 其作用机制如上图所示，主要包括以下几种情况： 1) 在编码蛋白基因的上游启动子区（橘色）转录，从而干扰邻近蛋白编码基因（蓝色）的表达（如酵母SER3基因）； 2) 抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因（蓝色）表达； 3) lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式； 4) lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平； 5) lncRNA（绿色）结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性； 6) 作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体； 7) 结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位； 8) 可作为小分子RNA（如miRNA）的前体分子。 科研可以是一种快乐 关注基金申请、聚焦科研热点、解读实验难点 |
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