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前言 细胞外囊泡（EV）是膜包围的结构，其将生物学上重要的分子从释放传递到靶细胞，从而提供新颖的细胞间通信机制。由于EVs以受保护的形式携带货物并且其分泌通常在肿瘤发生中增加，因此EVs具有早期癌症诊断的巨大潜力。4月26日塞梅尔韦斯大学遗传学，细胞和免疫生物学团队在Cellular and Molecular Life Sciences上发表了“Extracellular vesicle release from intestinal organoids is modulated by Apc mutation and other colorectal cancer progression factors”，通过3D培养，提供证据表明结直肠癌（CRC）患者衍生的类器官，代表了用于研究人类CRC的最先进的已建立和必要的方法，是用于EV分析的合适模型。当测试促进CRC进展的主要因素对类器官模型中EV释放的影响时，观察到Apc突变导致不受控制的Wnt活化并因此导致绝大多数CRC患者的肿瘤发生，通过激活Wnt途径临界诱导EV释放。此外，已知在肿瘤发生中累积的细胞外基质成分胶原蛋白也增强了EV分泌。重要的是，显示成纤维细胞衍生的EV在缺氧条件下诱导CRC有机体细胞的集落形成。相反，肿瘤细胞衍生的EV对成纤维细胞的活化没有主要影响。总的来说，用CRC和Apc-突变腺瘤类器官的结果确定Apc突变和胶原沉积是增加肿瘤EV释放的关键因素。此外，文章表明基质成纤维细胞衍生的EV在CRC的不利条件下促成肿瘤发生。  研究思路  Figure 1:CD63 + EV从3D培养中释放出来。a 将所示细胞系的细胞2D培养，并通过抗CD63包被的珠子捕获EV，通过抗CD63或膜联蛋白V检测，并用流式细胞术测量阳性珠子的百分比。 b 从2D培养上清液中检测EV门中的膜联蛋白V +事件。注意，在测量之前通过离心除去含有凋亡小体的最大EV。在这些实验中，通过流式细胞术直接测量EV。 （c-d）来自Matrigel（c）中或Matrigel培养后3D培养的菌落的阳性珠子的百分比，将菌落维持在悬浮液（d）中48小时。 e SW1222细胞上清液中膜联蛋白V+数量，来自3D培养物或从Matrigel中移除后保持悬浮的菌落。 f SW1222细胞在不同培养条件下活性caspase-3的百分比。  Figure 2:可以在3D培养物中测量CRC患者类器官衍生的EV。a CRC患者衍生的类器官的形态学。 b 分别通过抗CD81或抗CD63检测的EV结合的抗CD81或抗CD63包被的珠子的百分比。在48小时后处理来自没有（基质胶）或具有类器官的3D培养物的上清液。 c 来自五种类器官培养物的粒度分布和颗粒数。 d 通过差速超速离心分离的CRC有机体衍生的EV的透射电子显微图像。  Figure 3:将Matrigel替换为胶原蛋白I导致CRC类器官的EV释放升高。 a CRC类器官系的Vimentin整体免疫染色，在基质胶或胶原蛋白中培养。 b 源自人CRC类器官的CD81+珠的相对百分比。进行成对实验，并且在每个实验中将标准化为细胞数的胶原数据与标准化的基质胶衍生数据进行比较。 c CRC类器官中活性caspase-3 +凋亡细胞的定量。  Figure 4:在Apc突变后，小鼠肠类器官释放更高量的EV。 a小鼠肠器官的形态学和Apc突变后。注意，没有RSpo，只有Apc-突变体，而不是野生型的类器官存活。 b CD81+珠子的百分比，标准化为相等的细胞数。将抗CD81包被的珠子在WT或sgApc培养物的上清液中温育，并通过抗CD81检测EV结合的珠子。 c用Wnt3a处理的WT，Apc-突变体和WT类器官的共聚焦显微图像。在共聚焦显微镜图像中计数存在Apc突变或指定处理时Ki67+（d）或粘蛋白2+细胞（e）的百分比。在用CHIR99021处理的活化Wnt途径的类器官的情况下，将结果与保持在1％DMSO中的对照样品进行比较。 f 所示基因的相对RNA水平。 g CD81 +珠子的相对百分比。 h Apc突变和指定治疗后活性caspase-3 +细胞的百分比，在共聚焦显微镜图像上计数。  Figure 5:来自缺氧成纤维细胞的EV诱导CRC细胞的类器官形成。a 收集来自Thp-1细胞或成纤维细胞（Fibr）的培养基，超速离心并加入上清液或沉淀。注意，在细胞培养的情况下，颗粒含有EV。作为对照，应用培养基。然后使用CRC类器官细胞测试来自含氧量正常（a）或低氧条件（b，c）的样品，并且在4天后将集落形成计数为常氧（a，b）或缺氧（c）中的读数。 d用脂质体处理后的新类器官数量。注意脂质体在常氧或缺氧条件下培养，加入CRC类器官细胞，分别在常氧或缺氧条件下测试器官形成。 结论 文章显示，在3D球状体的上清液中可以检测到较小的EV，与培养基质无关。提供证据表明患者来源的类器官产生可在培养上清液中分析的EV，从而提供证据表明基于Matrigel的3D器官培养物适合于CRC中的EV研究。数据还表明，CRC肿瘤发生中的关键因素，例如Apc突变或胶原蛋白I沉积，改变了肿瘤类器官的EV释放。有趣的是，尽管成纤维细胞衍生的EV诱导肿瘤细胞在缺氧时的集落形成能力，但无法检测到有机体EV对成纤维细胞活化的主要影响。 到目前为止，大多数研究使用2D细胞培养来揭示CRC和其他癌症中EV的功能。然而，使用不同的细胞系和不同的培养条件导致数据具有低一致性。这可以通过这些细胞系代表不同患者的事实来解释，并且在2D培养建立方案期间，对于适应2D条件的快速增殖的肿瘤细胞存在选择性优势。最近开发的3D类器官技术代表了一种卓越的模型，可以维持体内肿瘤的细胞异质性而无间充质细胞。此外，他们的培养条件是标准化和优化的，以最好地代表这种异质性。有趣的是，当比较3D培养物时，检测到悬浮液中凋亡细胞的比例与基质胶中的培养相比增加，尽管凋亡群体的大小是细胞系特异性的。因此，3D悬浮培养可能仅是一些但不是所有癌细胞系和患者衍生的类器官的替代方案。有趣的是，在源自细胞系的3D培养物中，CD63 + EV占主导地位，而器官样品培养物产生更多CD81+囊泡，因此提高了在细胞系和基于器官的系统中释放的EV可能不同的可能性。这与先前的研究一致，显示EV标记在细胞类型之间不同，并且没有用于EV检测的通用分子。然而，这些EV在功能上是否彼此不同仍然需要解决。 不同的细胞系以不同的水平释放EV亚群，并且EV亚群可能由于其不同的生物发生和分子货物而具有不同的功能。虽然EV的分子组成受到蛋白质翻译后修饰的影响，但其他机制却鲜为人知。由于没有遗传模型来阻止仅一个特定EV亚群的释放，最近，已经建议基于大小对EV进行分类。重要的是，与2D和3D悬浮培养相反，3D基质中的菌落和类器官的上清液优选含有较小的EV。 尽管体内和体外研究显示肿瘤细胞的EV释放升高，但仅在少数报道中已经解决了造成这种影响的因素。KRAS突变是许多癌症类型中另一个重要的遗传事件;在CRC中，对突变体KRAS的研究主要集中在EV分子货物的变化上，并显示了一些RNA的选择性包装。因此，EV释放是由Apc突变后的类器官诱发的，这是CRC中的一个关键遗传事件，并且在基于EV的诊断工具是在CRC中经常累积的ECM蛋白I的存在下特别感兴趣。开发用于监测来自体液的肿瘤衍生的EV。此外，文章研究表明，Apc突变通过诱导Wnt途径发挥其对EV释放的增强作用。Wnt活性和细胞增殖在肠上皮和肠腺瘤中紧密相关。但是，由于所有数据都标准化为细胞数量，因此增加的细胞数量无法解释更高的EV释放。值得注意的是，需要进一步的研究来确定较高的EV分泌是否是Wnt途径的直接影响，或者它是否反映了Wnt诱导的不同细胞群相对比例的变化。 基质成纤维细胞通过产生肝细胞生长因子（HGF）来建立癌症干细胞表型，并且TGFβ处理激活成纤维细胞以部分通过IL-11促进转移，从而对CRC肿瘤发生起决定作用。此外，基质基因表达模式与CRC疾病结果之间存在很强的相关性。CRC细胞衍生的EV通过miR-145极化肿瘤相关巨噬细胞，因此表明这些EV可能在一些细胞群中具有活性。有趣的是，与乳腺癌相反，癌细胞来源的EV介导Wnt平面细胞极性信号传导的基质动员，导致肿瘤细胞迁移，无法检测出类器源衍生的EV对成纤维细胞活化的显着影响。然而，成纤维细胞EV对缺氧时CRC有机体集落形成能力具有增强作用。Hu等人进一步支持了成纤维细胞来源的EV的重要性。他发现成纤维细胞衍生的EV有助于CRC的化疗耐药。在另一项研究中，癌症相关的成纤维细胞EV仅在缺氧和脂质饥饿时支持胰腺癌侵袭，因此表明EV在某些癌症模型中仅在不利条件下才具有功能。 总之，使用新型3D器官模型，文章表明CRC启动和进展中的关键因素，如Apc突变，诱导肿瘤细胞释放EV。此外，成纤维细胞衍生的EV增强了缺氧条件下CRC有机体细胞的集落形成能力。文章研究结果强调了有机体技术在EV表征研究中的作用，它们为使用EV作为CRC的诊断标记提供了线索。 全文链接: https://pan.baidu.com/s/1TVMtba1fFAuLM7swwhzY9w 提取码: dmw4 EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。 |
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