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由上皮肿瘤细胞生成的患者源性类器官（PDO）可以反映肿瘤特征，是一种有效的药物筛查工具。然而，它们不能预测部分药物的治疗反应，研究人员猜测可能是缺乏复杂的肿瘤微环境（TME）。 今天小学社给大家带来一篇关于研究肿瘤微环境对PDO影响的8分文章，本研究深入研究了PDO和正常成纤维细胞（NF）或癌症相关成纤维细胞（CAF）之间的相互作用，一起来学习吧！ 
结直肠癌(CRC)是癌症相关死亡的第四大原因。尽管目前医学科技已经有了很大进步，但晚期CRC患者的治疗选择仍然有限，化疗作为临床治疗的主要选择通常会产生耐药反应，因此需要开发一种新的治疗方法。 本研究提出了一种新的共培养PDO模型，它将CRC衍生的上皮细胞和患者匹配的成纤维细胞共培养。利用该模型研究了PDO和NF或CAF之间的相互作用。研究结果表明该模型是用于药物开发、精准医学、预测治疗反应和提高对肿瘤-间质相互作用的癌症生物学理解的有效工具。 
1. 用蛋白质组学和分泌组学分析正常和肿瘤间质成纤维细胞的特征 为了研究NF和CAF的差异在体外的稳定性，研究团队从邻近正常组织和CRC样本中分离的患者匹配的NF和CAF的早期传代中收集总蛋白。 通过对4组患者匹配的NF/CAF进行蛋白质组学分析，发现有235个蛋白组表达差异显著；与细胞外基质（ECM）组织、胶原蛋白生物合成和细胞附着有关的分子在CAF中显著失调。此外，两组成纤维细胞之间，一些免疫途径也受到显著影响；在重要的靶点中，研究人员发现了与细胞迁移和细胞收缩相关的蛋白质在CAF中增加了2- 3倍。 此外，通过对7对匹配的NF和CAF的培养基进行分泌组学分析，研究人员发现了12个在CAF和NF之间显著失调的分子；验证了肌成纤维细胞标记物MYLK和血管细胞粘附分子VCAM1的表达差异。 这些数据表明NF和CAF在体外保留了功能蛋白质组和分泌组，反映了CAF中的肿瘤相关通路(图1)。 
图1 2. 胶原凝胶运动实验揭示了CAF和NF之间的表型差异 基于上述分析数据，研究团队通过3D胶原凝胶运动实验评估了CAF和NF在表型上的差异，结果发现，与NF相比，CAF中扩散面积、突起数量和从球形结构分离的单细胞数量显著增加（图2）。这一发现表明CAF在3D胶原凝胶中的运动能力显著增加。 
图2 
3. CAF和NF支持类器官生长的共培养 研究团队建立了一个患者源成纤维细胞和PDO共同培养的模型，来研究肿瘤细胞和基质成纤维细胞之间的相互作用。该模型采用极低含量介质（1％胎牛血清[FBS]）的培养基，并省略了传统类器官培养基中可以改变成纤维细胞信号传导和表型的生态位因子或抑制剂。 结果显示，该模型中共培养出的类器官活力和大小与单纯类器官一致（图3），并随着共培养成纤维细胞的数量显示出剂量依赖性生长。结果表明，NF或CAF来源的因子同样有效地支持类器官的生长和存活能力。 
图3 
4. 类器官-成纤维细胞共培养密切代表患者组织学 研究团队将原始切除肿瘤的组织形态与NF和CAF的共培养和单纯培养类器官进行了比较。结果显示，NF和CAF共同培养的类器官与患者原发肿瘤具有高度相似的组织形态，其中肠细胞分化标志物CK20的异质性得到了显著表达；而在无成纤维细胞的培养基中生长的类器官与原发肿瘤相比则相似性较低，CK20表达均匀且粘液产生不明显（图4）。 由此看来，各种类型细胞的存在证明了与NF或CAF共培养的类器官与体内原始肿瘤明显相似。 
图4 5. 共培养诱导特异性基因表达 研究团队对共培养的类器官进行批量RNA测序后确定了1742个失调基因，以及与胶原生物合成和ECM组织相关的主要变化通路，发现成纤维细胞与PDO的共同培养强烈影响肿瘤细胞中ECM的重塑和细胞通路（图5）。 接下来，研究人员分析了单纯培养和共培养的成纤维细胞表达谱，发现肿瘤细胞诱导高度特异性基因的表达来增强其致瘤性。此外，成纤维细胞通过分泌多种不同的生长因子和细胞因子来支持类器官的生长和增殖（图6）。 
图5 
图6 6. 与成纤维细胞共培养的类器官表现出与原发性肿瘤一致的基因表达 研究发现共培养环境下特定基因表达更接近于患者样本，表明在类器官共培养中从干细胞样细胞向更异质性的细胞模式转变可能与肿瘤发展相关。此外，研究还发现在共培养条件下，一些基因被上调或下调，表明肿瘤可能通过增强CAF功能或诱导NF中的促癌基因表达来抑制肿瘤抑制信号对成纤维细胞表型的作用（图7、8）。
图7
图8
7. 大量RNA测序数据的反卷积揭示了在不同条件下生长的类器官中基因特征的不同 为了验证共培养模型，研究团队利用生物信息学反卷积策略对RNA-seq数据进行分析。研究人员结合不同的肿瘤标记和上皮标记，确定了不同条件下生长的类器官的细胞成分，并发现共培养可以影响细胞成分。同时，发现了在不同条件下标记基因表达的变化，包括与肿瘤进展和转移等相关的基因上调以及与分化相关的基因下调。这些数据表明结肠PDO和成纤维细胞的共同培养可诱导更多种类的上皮细胞（图9）。
图9
8. 鉴定成纤维细胞和上皮细胞之间的功能性相互作用，THBS1是成纤维细胞侵袭的关键因素 研究团队利用CellphoneDB工具推断共培养体系中不同细胞类型间的相互作用。基于RNA-seq和scRNA-seq数据，研究发现不同成纤维细胞之间以及成纤维细胞和类器官之间存在大量相互作用，特别是当CAF与类器官共同培养时，数量会增加。 此外，还发现了CAF分泌的细胞因子和趋化因子具有显著相互作用。同时，研究还确定了CAF的特异性因子THBS1，并对其进行了类器官共培养模型中的生物学影响评估，研究发现，与NF相比，CAF分泌组中THBS1表达升高。 最后，本文还验证了THBS1在原发性肿瘤和共培养体中的表达水平。这些数据表明了患者和共培养体中THBS1的RNA和蛋白表达的一致增加，并展示了其对CAF表型的生物学功能（图10、11）。
图10
图11
肿瘤类器官模型展现出了在精准医疗方面的巨大应用潜力，成为肿瘤研究领域的新热点。此项研究提出并验证了一种CRC的PDO模型，为建立更真实的肿瘤类器官模型提供了新思路。 研究还指出，该模型能够更好地模拟原发性肿瘤的生物学和生理学特性，并有助于研究肿瘤和间质细胞之间的交流方式以及减少治疗耐药性的方法。 未来的研究需要进一步探索肿瘤和间质细胞内单个细胞的表达变化，以及验证该模型的准确性，以便提供更精密的治疗方案，并为筛选新的治疗方法提供新途径。希望这项研究能为开发更有效的癌症治疗方法开辟道路！ 来源：类器官学社 |
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