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详解核酸等温扩增技术

2019-05-04  qianfengnh

近年新发展起来的核酸等温扩增技术,无论是在实际操作还是仪器要求方面,都比PCR 技术更为简单方便,它摆脱了对精良设备的依赖,在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中,环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用,其他一些新发展起来的等温扩增技术,如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术,也在不断发展与完善之中。为了更好地有选择地开发利用这方面技术,现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。


环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermalamplification,LAMP )

环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术,其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物,包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物,3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶,使得链置换DNA合成不停地自我循环,从而实现快速扩增。反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。此反应先形成哑铃状模板,进入循环扩增阶段,再进行伸长、循环扩增,共3个阶段。

Loop-mediated isothermal amplification(LAMP,Fig1)


依赖核酸序列的扩增 (Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)

依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA) 是 1991 年由加拿大 Can -gene 公司首次介绍。它是一项以核酸序列中 RNA为模板,由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。整个反应由非循环相和循环相组成: 首先进行非循环相,在AMV 逆转录酶的作用下,引物 I 与模板 RNA 退火后合 成 cDNA,形 成 RNA/DNA 杂 合 体,随 即RNaseH 降解 RNA,引物Ⅱ与 cDNA 退火,合成第二条 DNA 互补链。形成的 DNA 双链由 T7 RNA 聚合酶识别启动子序列,催化合成 RNA,进入循环相,对模板进行大量扩增。

Nucleic acid sequence-based amplification(NASBA,Fig2)


滚环扩增技术 (Rolling circle amplification,RCA)

1998 年建立的滚环扩增 (RCA) 是模拟自然界微生物环状 DNA 的滚环复制过程,发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。在具有链置换活性的 DNA 聚合酶作用下由一条引物与环形 DNA 模板的链置换合成,实现环状 DNA 模板的体外等温线性扩增。可分为线性扩增 (单引物 RCA)、指数扩增、多引物扩增和信号扩增RCA。

Rolling circle amplification(RCA Fig3)


单引物等温扩增技术(Singleprimerisothermalamplification,SPIA)

SPIA的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶,由3'端DNA部分和5'端RNA部分组成。在反应过程中,RNaseH不断降解引物区DNA/RNA双链中的RNA部分,暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点,然后新引物结合上去进行链置换合成,经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程,实现模板互补序列的快速扩增。

Singleprimerisothermalamplification(SPIA Fig4)


依赖解旋酶 DNA等温扩增技术 (Helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)

依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术 (HDA) 是美国NEB 公司于 2004 年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内 DNA 复制的自然过程,利用解旋酶在恒温下解开 DNA 双链,再由 DNA 单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板,然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互补的双链,继而不断重复上述循环扩增过程,最终实现靶序列的指数式增长。

the helicase-dependent amplification system(HDA Fig5)


重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)

RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37°C左右。

Recombinase polymerase amplification (RPA,Fig6)


链替代扩增 (Strand displacement amplification,SDA)

链替代扩增 (SDA) 技术最早是由 Walker等人于 1992 年在 《美国国家科学院汇刊》中进行了介绍,这是一种基于酶促反应的 DNA 体外等温扩增技术,主要利用限制性内切酶剪切 DNA 识别位点的能力和 DNA 聚合酶在切口处向 3'延伸并置换下游序列的能力,在等温条件下进行扩增。整个过程由准备单链 DNA 模板、生成两端带酶切位点的目的 DNA 片段、SDA 循环扩增 3 个步骤组成。

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