定量PCR的那些事

  定量PCR又被称Real-time PCR或是Quantitative Real-time PCR（以下简称Q-PCR）。现在很多实验室都有涉及到这一实验技术，这篇文件将讲述Q-PCR的原理，实验过程以及一些问题分析。

Q-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

• 扩增曲线：反应了Q-PCR动态进程的曲线。如图1

• 荧光阈值：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），荧光阈值的默认设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，如果手动设置则设置大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，进入指数期的最初阶段。如图1

• CT值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如图1

Ct值定量的数学原理

1. 理想的PCR反应：

Xn＝X0*2n

n：扩增循环数；X0起始模板数量；Xn：第n次循环后扩增产物数量

2. 非理想的PCR反应：

Xn＝X0*(1+En)n

n：扩增循环数；X0起始模板数量；Xn：第n次循环后扩增产物数量；En：扩增效率

在扩增产物达到荧光阈值时

（1）XCt＝X0*(1＋En)Ct＝M

XCt:：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M

方程式：

（1）两边同取对数得

（2）Log2M＝Log2X0 *(1＋En)Ct

整理方程式（2）：

Log2X0= Log2M - Ct Log2(1＋En)

因此起始模板量的log值与CT值成线性关系，模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。

常用荧光定量标记方法

1. 非特异性荧光标记：SYBR Green I

这是一种最为常用的荧光标记。它是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。如图2

SYBR Green I 染料法——优缺点

优点：使用方便，不必设计复杂探针；具有价格优势

缺点：无模板特异性；对引物特异性要求较高；不能进行多重定量；灵敏度相对较低

2. Taqman 探针法

• 5’ 端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等。如图3

• 3’ 端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。如图3

• 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，但是Taq酶有5’→3’ 外切核酸酶活性，在PCR进行时，可水解探针将R与Q分开，R就能发荧光。如图3

Taqman 探针法——优缺点

优点：高度特异性；重复性好；灵敏度高；可进行多重定量

缺点：只适合一个特定的目标；委托公司标记，价格较高；不易找到本底低的探针

Q-PCR引物设计原则（主要是SYBRGreen I 染料法，★数量代表了优先程度）

Q-PCR的流程（主要是SYBR Green I 染料法）

1. RNA抽提：利用试剂盒或是传统的Trizol抽提样本总RNA。之后利用NanoDrop或是Qubit对抽提的RNA进行浓度测定，并进行电泳检测，确定RNA的完整性。

2. 反转录：每个样本根据浓度选取相同的量进行反转录，反转录产物稀释10倍混匀后-20℃保存备用。

3. Q-PCR：更具不同试剂盒所提供的反应体系配置。因为SYBR Green染料在强光的照射下会对染料造成影响。但是其实也不用过分的小心。一般来说Q-PCR的操作环境要求在没有DNA和RNA污染的环境且没有DNA酶。因此需要实验室有一个专门的定量房间，如果实验室条件不允许也可以在超净台中进行操作，并佩戴无菌乳胶手套。由于染料对光线敏感，操作时应避免强光的照射，如果操作允许，可以适当降低环境灯光亮度，但不必过分担心，主要还是操作过程要快。加完样品后上机PCR。

4. 数据分析：主要是看扩增曲线，CT值，以及溶解曲线。

以上就是Q-PCR的一个大致流程，所有实验中遇到的试剂或是耗材都要求无菌无RNase以及DNase。

实验中可能会遇到的问题：

• CT值一般来说如何才是理想的？

• 答：一般来说CT值在30以下都可以认为实验结果是可靠的，如果CT值大于30那么基本上可以说明该基因没有扩增。但这也不是绝对的，还可以通过分析产物电泳结果，也可以分析溶解曲线。

• 溶解曲线如何分析？

• 答：一般正常的溶解曲线的峰应该出现在80℃以上且有且只有一个单一的峰，这样的实验结果是可靠的。如下图。

• 如果出现双峰，则说明有非特异扩增或是有引物二聚体（如下图），这样就需要电泳检测是引物二聚体还是非特异扩增。如果是引物二聚体那么可以适当降低引物浓度或是提高退火温度。如果是非特异扩增则除了提高退火温度外还可以重新设计新的引物。

• 为什么我的三个复孔间的CT值差异巨大？

• 答：这可能是因为配置混样后没有充分混匀，导致三个复孔间会出现差异。还有一种可能就是引物设计缺乏特异性或是引物与模板不匹配，这样也会导致复孔的结果出现差异，建议充分混匀反应mix，还是不行则考虑重设引物。

• 为什么我的内参的CT值也很高超过30？

• 答：先确定你的引物是否来源于成熟的文献，也就是排除引物的问题。如果确定引物无为题，那就有可能是RNA的抽提时出现了降解导致了RNA片段的不完整，这样就需要重新抽提RNA并反转。如果内参基因是自己设计的，那就需要重新验证该基因的可行性，尽量选择成熟有过验证的内参基因。

• 为什么我做的基因包括内参基因的溶解曲线都有双峰？

• 答：这种情况就说明有基因组DNA的污染。在反转录结束后，cDNA需要进行简单的基因组排除验证，利用有跨越内含子的引物做PCR。模板利用cDNA以及基因组DNA，看条带大小。一般来说以cDNA为模版的产物小于基因组的产物。条件允许的可以选择带有去基因组酶的反转录试剂盒。

• 为什么我同一个基因做不同的样本有的样本的CT特别低，扩增曲线很早就起峰？

• 答：这是由于模板的起始浓度过高，可以尝试稀释模板，因为模板浓度过高不利于Q-PCR。