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编者按： 科学私享秉承「解读英文文献，拓展科研思路」的精神，编译了“JAFC”最新英文文献一篇。 2019年4月30日，德国慕尼黑工业大学Thomas Hofmann教授团队在Journal of Agricultural and Food Chemistry（1区，IF：3.412）发表了题为“Discovery of a Thiamine-Derived Taste Enhancer in Process Flavors（在加工香料中发现硫胺素衍生的味道增强剂）”的研究文章，作者从食品化学角度，运用感官组学，借助HPLC、LC-MS等众多工具系统的研究了加工香料中的味道增强剂的硫胺素衍生物。该方法对于研究其他食品加工香料的风味物质具有借鉴意义。 如果您觉得「科学私享」分享的文献不错，欢迎您随手转发到朋友圈，QQ群和微信群，也欢迎您收藏，以备后续阅读所用。 最后「科学私享」祝您学有所获！ 科学私享 2019.05.01  第一作者：Laura Brehm 通讯作者：Thomas Hofmann 通讯单位：德国慕尼黑工业大学 DOI: 10.1021/acs.jafc.9b01832 文章概述 商业肉类加工香料中48种基本味道活性化合物的靶向定量，剂量超过阈值因子的计算和基本味道再造，随后是揭示活性导向的分馏，接下来L-谷氨酸和5'-核糖核苷酸，一系列N-乙酰化氨基酸和S -（（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）-L-半胱氨酸作为调味化合物。N-乙酰化氨基酸赋予厚味增强功能，在模型肉汤中具有高达1800 μmol/ L（N-乙酰甲硫氨酸）的高滋味阈值。相比之下，发现由硫胺素和半胱氨酸的美拉德反应形成的S - （（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）-L-半胱氨酸首次表现出强浓度高于120μmol/ L的低浓度（模型肉汤）。  ▲摘要图 背景介绍 在西方国家，素食主义者和严格素食者的数量不断增加。因此，素食和纯素替代产品的市场正在增长。为了满足消费者对素食和纯素食品的要求，使用所谓的加工香料分别提供热处理的鸡肉，牛肉和猪肉的令人愉悦的风味特征，而不使用任何动物源性成分。国际食用香料工业组织（IOFI）将加工香料定义为通过加热食品成分和/或允许用于食品或加工调味剂的成分而为其调味特性制备的热加工调味剂。在加工香料生产中，前体如氨基酸，还原糖，硫胺素，核糖核苷酸，磷脂，酵母提取物和水解植物蛋白，在受控条件下（温度，反应时间，pH）进行热处理。还原碳水化合物与氨基酸和肽等氨基组分之间的美拉德反应，氨基酸中Strecker醛和酸的形成，以及形成肉类风味剂硫胺素的形是风味产生的最重要的反应。 虽然消费者对热加工食品的接受度也受到非挥发性味道活性化合物的影响，但风味研究主要集中在挥发性香气成分上。然而，鲜味（umami）和厚味（kokumi）物质也对加工香料的咸味和肉味起着重要作用。除L-谷氨酸和核糖核苷酸外，例如，从水解大豆蛋白或向日葵蛋白反应混合物中分离出1至5kDa的分子量级分，和碳水化合物显着增加了肉汤的浓厚活性，口感和连续性。 近年来，感官组学方法分别使用味道稀释分析（TDA）和比较味道稀释分析（cTDA）来定位和识别赋予食品和模型反应系统典型味道的关键分子，揭示以前未知的鸡肉汤，煮熟甲壳类动物，热加工牛油果，炖牛肉/蔬菜汤和金黄色鸡油菌滋味物质。 尽管肉类加工香料的市场增长迅速，但在加工香料生产过程中由天然材料产生的味道增强分子的化学结构和形成机制的知识仍然相当零碎。任何以前未知的风味增强剂的知识将有助于优化配方和制造参数，目标是具有肉类真实性的优质工艺口味。本研究的目的是首次将感官组学方法应用于商业加工香料，以便定位，识别和感官表征关键的味道和味道调控原理。 材料和方法 1试剂 2 基本味道化合物的定量分析 为了定量120种基本促味剂（tastant），适量（1 mg）的加工香料（PF1-PF8）溶解在水（1mL）中，并且在膜过滤（0.45μm）后，在分析前直接分析样品或在用水稀释1：5之后分析样品。阳离子，阴离子和碳水化合物通过高效离子色谱（HPIC）进行定量；游离氨基酸，核苷酸和核苷，N-修饰核苷酸，有机酸和γ-谷氨酰肽通过先前报道的LC -MS / MS方法定量。 3 加工风味剂PF5的连续溶剂分馏（Sequential Solvent Fractionation） 将一部分（30g）PF5溶解在水（200mL）中，用蒸馏的乙酸乙酯（2×200mL）萃取，并将合并的有机层在真空中与溶剂分离，得到乙酸乙酯可萃取物。将残留的水层冷冻干燥，将等分试样的冻干物（2.5g）溶解在水（10mL）中并用乙腈（20mL）萃取。相分离后，倾析出上层乙腈相，用乙腈（4次，每次20mL）萃取水相。合并乙腈（ACN）相，真空除去溶剂，将残余物以及剩余的水相冻干，得到ACN提取物和水可溶物。将提取物储存在-20℃直至进一步使用。 4 乙腈-提取物的尺寸排阻色谱（SEC） 将等份的冻干乙腈-提取物（500mg）溶解在水（5mL）中并加到装有LH-15材料（GE，Healthcare，Uppsala，Sweden）的玻璃柱上。用调节至pH4.0的水（用甲酸）和3mL / min的流速洗脱化合物。通过UV检测器（UV-2075，Jasco，Groß-Umstadt，Germany）在λ= 200nm处检测流出物，并分离成八个级分（级分SEC-1-SEC-VIII）。采用收集器（Spectrum Europe BV，Breda， 荷兰）收集CF-2馏分。在进行感官实验和化学分析之前，先将合并的级分冻干并贮存于- 20℃。 5 SEC-级分III的亚组分 将冻干的SEC级分III的等分试样（250mg）溶解在水（10mL）中。在膜过滤（0.45μm）后，将溶液在250×10mm内径，10 μm，Nucleodur-C18-Pyramid柱（Machery Nagel，Dueren，Germany）上分级。用UV-检测器（λ= 254nm）监测流出物，甲酸溶液（0.1％）作为溶剂A和乙腈作为溶剂B，以4.5 mL / min的流速进行色谱测定。从0％ B开始5 min，梯度洗脱在22min内增加至60％ B。在另外2 min内，梯度增加至100％ B并保持1min。然后，将柱在2 min内调节至0％B并保持3 min平衡。将HPLC流出物分别收集到11个级分中，即SEC-III-1至SEC-III-11，在进行感官实验和化学分析之前，先将合并的级分冻干并贮存于- 20℃。 6 鉴定亚组分III-1中的味道调控化合物 将冻干的HPLC级分III-1（20 mg）溶于水（2mL）中，膜过滤（0.45μm），然后通过半制备亲水作用液相色谱（HILIC-HPLC）TSKgel Amide 80柱上分离（250×21.5 mm id，10μm，Tosoh Bioscience，Stuttgart，Germany）。用UV检测器（λ= 254nm）监测流出物，使用甲酸水溶液（0.1％）作为溶剂A和乙腈作为溶剂B，以8mL / min的流速进行色谱法。以80％B开始3 min，梯度洗脱在9min内降至0％B并保持1分钟。在另外2分钟内，将梯度增加至80％B并保持3min以进行平衡。分别收集HPLC流出物，得到两个亚级分，即III-1-a和III-1-b，将其冻干两次。采用紫外-可见，LC-MS / MS，TOF-MS和1D/2D-NMR 鉴定SEC-III-1-a为N -（（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）甲酰胺；SEC-III-1-a为S -（（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）-L-半胱氨酸 N - （（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）甲酰胺（7），图6：UV-Visλmax= 254 nm（MeOH / H2O，50/50，v / v）; UPLC-TOF-MS：m / z 167.1061 1H NMR（400MHz，MeOD-d4，298 K）：δ（ppm）8.15 [d，J = 0.8 Hz，1H，HC（1'）]，7.94 [s，1H，HC（6）]，4.25 [s，2H，HC（7）]， 2.39 [s，3H，HC（8）]。13C NMR（100MHz，MeOD-d4,298K）：δ（ppm）167.84 [C（4）]，164.47 [C（1'）]，163.48 [C（2）]，155.35 [C（6）]，112.35 [C（5）]，36.45 [C（7）]，24.85 [C（8）]。 S - （（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）-L-半胱氨酸8，图6：UV-Vis λ max= 254 nm（MeOH / H2O，50/50，v/v）; UPLC-TOF-MS：m/z 243.0915; 1H NMR（400MHz，MeOD-d4,298K）：δ（ppm）8.07 [s，1H，HC（6）]，3.96 [t，J = 5.3Hz，1H; HC（2'）]，3.77 [d，J = 15.0 Hz，1H，Ha-C（7）]，3.70 [d，J = 15.0 Hz，1H，Hb-C（7）]，3.00 [d，J = 5.3 Hz，2H，HC（3'）]，2.57 [s，3H，HC （8）];13C NMR（100MHz，MeOD-d4,298K）：δ（ppm）173.49 [C（1'）]，164.31 [C（4）]，162.58 [C（2）]，142.55 [C（6）]，112.23 [C（5）]，54.13 [C（2'）]，31.95 [C（3'）]，28.78 [C（7）]，21.63 [C（8）]。 7 硫胺素和半胱氨酸的热反应 将硫胺素（1mmol）和半胱氨酸（1mmol）在磷酸盐水溶液（10mL; pH7; 0.1mol / L）中的二元溶液在120℃下热处理120 min。冷却后，将混合物通过RP-HPLC在250×10.00mm苯基-己基柱（Phenomenex Aschaffenburg）上分离成9个级分，其中级分2含有显示准分子离子的靶分子，m / z为243.0915。光谱（1H NMR，LC-MS）和色谱数据的比较证明了从馏分2和从加工香料PF5中分离的味道调控剂8获得的反应产物的特性，因此证实了S -（（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）-L-半胱氨酸由硫胺素和半胱氨酸产生。 8 感官分析 8.1 感官小组培训 8名女性和9名男性小组成员（年龄23-40岁），没有已知的味觉障碍史，并且已经知情同意参加目前的感官测试，每周培训8次培训至少两次年，为了熟悉所用的口味表达和方法，评价标准溶液的滋味（2.0 mL; pH 5.9）：甜味为蔗糖（50 mmol / L），酸味为L-乳酸（20 mmol / L） ），盐味为NaCl（20 mmol / L），苦味为咖啡因（1 mmol / L），鲜味为L-谷氨酸单钠（3 mmol / L）。为了训练口感增强和复杂性增加的活性，创造了浓厚的厚味活性。 8.2 味道轮廓分析 将部分（5.0g）加工香料分别溶解在水（1L）和模型肉汤（1L）中，并用痕量的1％甲酸将pH值调节至5.4。该小组成员被要求从0（不可感知）到5（强烈可感知）的等级评定味道质量：鲜味，咸味，苦味，甜味，酸味以及浓厚感的强度。当将加工香料溶解在模型肉汤中时，将评级与不含任何添加剂的模型肉汤进行比较。各个小组成员的评级进行平均。 8.3 比较味道稀释分析 为了定位鲜味和厚味物质，根据文献进行比较味道稀释分析。将冻干的SEC和HPLC级分分别用相同体积的模型肉汤溶解，并用痕量甲酸（1％水溶液）将pH值调节至5.4。用模型肉汤以1:1连续稀释储备溶液，直至达到256的稀释因子，然后，使用模型肉汤作为参考和空白的二三测试（duo-trio test）装置，以增加浓度的顺序将溶液呈现给感官小组（对照）。比较味道稀释（cTD）因子定义为第一稀释步骤，其中样品和空白之间的差异是可检测的。所有小组成员的cTD因子取平均值。 8.4 味道阈值确定 分别在水（本来味道）和模型肉汤（味道增强）中制备确定浓度的测试化合物的溶液，然后以1：1连续稀释，并使用二三测试以增加浓度的顺序呈现给小组成员。用水或模型肉汤作为参考和空白（对照）的测试程序。将可检测到空白和样品之间的差异的第一稀释步骤定义为味道阈值。味道阈值计算为个体数据的几何平均值。 9 高效液相色谱（HPLC） HPLC装置（Jasco，Gross-Umstadt，Germany）使用由二元高压HPLC泵系统PU-2080 Plus，AS-2055 Plus自动进样器，DG-2080-53脱气装置，MD-2010 Plus型二极管组成。阵列检测器（Jasco，Gross-Umstadt，Germany）和Rh 7725i型Rheodyne注射阀（Rheodyne，Bensheim，Germany）。通过Chrompass色谱数据系统1.9版（Jasco，Gross-Umstadt，Germany）进行数据采集。 10 液相色谱-质谱（LC-MS） 使用连接到API 240 4000 QTrap MS / MS装置的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统或连接到5500 QTrap MS / MS系统的Shimadzu Nexera X2系统（Shimadzu，Duisburg，Germany）进行LC-MS / MS分析（ AB Sciex，Darmstadt，德国）。以正或负电喷雾电离（ESI ，ESI-）模式运行，两种仪器设置均使用以下条件操作：零级空气用作喷雾器气体（55 psi）和涡轮气体用于溶剂干燥（65 psi，450°C） ）; 供气帘气体（35 psi）和碰撞气体（8.7×10 - 7 psi）; 解离电位（-2 V）和入口电位（-10 V）。两个四极杆都设置为单位分辨率。ESI 和ESI -质量和产物离子光谱是用直接流动输注获取。对于ESI ，离子喷雾电压设定为5500 V和-4500 V代表ESI - 。去簇电压（DP），入口电位（EP），碰撞能量（CE）和单元出口电位（CXP）以及用于MRM模式测量的MS / MS参数均针对每种化合物进行了优化，以检测与氮气碰撞后分子离子在特定产物离子中的碎裂。对于仪器控制和数据采集，使用Sciex Analyst软件v1.6。 11 超高压液相/飞行时间质谱（UPLC / TOF-MS） 将溶于甲醇/水（30/70，v/v; 1mL）中的等分试样（0.1mg-1mg）注入Acquity UPLC核心系统（Waters UK Ltd.，Manchester，UK），连接至a SYNAPT G2 HDMS光谱仪（Waters UK Ltd.，Manchester，UK）以正电喷雾（ESI）模式运行，具有以下参数：毛细管电压（ 2.0 kV），采样锥（20 V），源温度（120°C） ，去溶剂化温度（450℃），锥形气体（5L / h）和去溶剂化气体（850L / h）。色谱分离在45℃下操作的柱（2.1×150mm，1.7μm，BEH C18，Waters UK Ltd.，Manchester，UK）上进行，溶剂梯度（流速0.4mL / min）为0.1％甲酸水溶液（溶剂A）和0.1％甲酸乙腈溶液（溶剂B）。从5％B开始，比例在4 min内增加到100％B。使用甲酸钠（0.5mmol / L）在2-丙醇/水（9/1，v / v）中的溶液，在m / z 100至1200的质量范围内校准仪器。使用亮氨酸脑啡肽作为参考对所有数据进行锁定质量校正（[M H] 的m / z 556.2771; [MH] - 的m / z 554.2615）。使用MassLynx软件（版本4.1; Waters）完成数据采集和分析。 12 核磁共振光谱（NMR） 在配备有Z-梯度5mm多核观察探针（BBFO plus）的Bruker 400MHz Avance III光谱仪（Bruker，Rheinstetten，Germany）上进行1D-和2D-NMR实验。使用氘代甲醇溶剂（MeOD-d 4，600μL）作为溶剂，并且以氘代甲醇溶剂信号为参考，以百万分率报告化学位移。使用Topspin NMR软件（版本3.2; Bruker，Rheinstetten，德国）和MestReNova10.0（Mestrelab Research，Santiago de Compostela，Spain）进行数据处理。对于定量核磁共振波谱（qNMR），使用先前报道的PULCON方法使用ERETIC 2工具校准光谱仪. 3.96 ppm（t，J = 5.3 Hz，1H）的隔离信号用于8的绝对定量，采用明确的L-酪氨酸样品作为外标，并使用7.10 ppm（m，2H）的特定共振信号进行分析。 图文解析  ▲图1（A，C）无酵母加工香料PF1 - PF3和（B，D）含酵母的加工香料PF4 - PF8在水中（5.0 g / L，pH 5.4）和模型肉汤（5.0 g / L）的味道分析，pH 5.4）。  ▲图2 PF1-PF8中滋味活性化合物的浓度（A）和DoT-因子（B; DoT> 0.1）的热图。定量和DoT数据可以在附件信息中找到。  ▲图3（A）加工香料PF5的乙腈-提取物的SEC色谱（λ= 200nm）和比较味道稀释分析（cTDA）；（B）HPLC-UV色谱图（λ= 254nm）和亚级分SEC-III的cTDA。  ▲图4 在级分SEC I中鉴定的（A）N-乙酰基氨基酸的化学结构：N-乙酰丙氨酸（1），N-乙酰基异亮氨酸（2），N-乙酰基亮氨酸（3），N-乙酰基蛋氨酸（4），N-乙酰基苯丙氨酸 （5），和N-乙酰基酪氨酸（6），和（B）在SEC-III-1部分中发现的硫胺素衍生物：N -（（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）甲酰胺（ 7）和S - （（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）-L-半胱氨酸（8）。  图5 S -（（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基）甲基）-L-半胱氨酸（8）的HMBC谱（500MHz，D2O）的摘录显示HC（3'）与C的偶联（7） '）ad C（2'）。 学者简介 Thomas Hofmann Hofmann教授（生于1968年），德国慕尼黑工业大学生命科学学院食品化学与分子感官科学系教授，研究食品和植物原料中感官，生物活性和技术功能天然产品的筛选，鉴定和定量。他还对这些化合物的代谢和结构-活性关系感兴趣。在埃尔兰根-纽伦堡大学食品化学专业学习后，霍夫曼教授获得博士学位（1995），并在德国慕尼黑工业大学（TUM）化学系完成博士后研究（1998年）。1998年，他被任命为德国食品化学研究所的代理主任，并当选为莱布尼茨学会会员。Hofmann教授于2002年被任命为明斯特大学食品化学研究所的教授和主任。2007年，他回到TUM，担任新成立的食品化学和分子感官主席的全职教授。自2007年以来，他一直是ZIEL食品与健康研究所的成员，自2009年以来，他一直担任研究和创新高级副总裁，自2015年起，他担任巴伐利亚生物分子质谱中心（BayBioMS）的2015年联合主任。他是泰国曼谷朱拉隆功大学理学院的高级客座教授（2015-2018）。作为欧洲财团的主席兼协调人，Hofmann教授还于2016年成功启动了欧洲理工学院（EIT）的知识与创新社区（KIC）“EIT FOOD”。 参考资料： http://www.professoren./en/hofmann-thomas/ |
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