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RNA甲基化近来很受高分期刊的亲睐，让我们一起看看近日中山大学药学院王红胜课题组在Nature Communications杂志发表的文章RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail的研究思路。文章主要发现肿瘤细胞上皮间质化（EMT）过程中mRNA的m6A显著上调，其可通过促进EMT关键转录因子Snail的翻译从而促进肿瘤EMT及侵袭转移。文中图片及数据均来源于Lin X, Chai G, Wu Y, et al. RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail. Nat Commun. 2019;10(1):2065. Published 2019 May 6. doi:10.1038/s41467-019-09865-9. （篇幅较长，耐心读，一定受益匪浅） 文章的主要内容为：与对照细胞相比，在肿瘤细胞EMT过程中，mRNAs的m6A修饰增加。敲低甲基转移酶METTL3的表达或过表达ALKBH5可以抑制癌细胞迁移、侵袭和EMT。m6A-seq和功能实验显示，Snail的表达受m6A动态调节，并且过表达Snail能逆转METTL3缺失导致的细胞EMT抑制。另外，Snail mRNA的CDS区而非3’UTR区的m6A修饰。功能研究摆明，Snail的CDS区域中的m6A可以通过与YTHDF1和eEF-2的相互作用而触发其翻译延伸。临床数据显示，肿瘤组织内含有与癌旁组织相比， METTL3和YTHDF1的表达量更高，这导致肝癌患者的预后更差。 研究目的与意义：1974年首次发现m6A甲基化，它是一种RNA分子上的甲基化修饰，m6A修饰在哺乳动物细胞中是动态可逆的，类似于DNA和组蛋白修饰的另一种表观遗传调控，近年来m6A甲基化已成为生命科学领域的研究热点。通过诸多学者辛苦研究，结果表明在mRNA中发现的m6A修饰可以调节癌细胞的生命活动。另外我们知道EMT是上皮细胞获得间充质细胞特质的一种重要现象，通过EMT诱导转录因子（例如Snail，Slug，Twist和Zeb）来抑制e-cadheri的表达促进癌细胞的转移，此外，Snail是e-cadherin表达的重要转录因子，近年来围绕EMT的表观遗传调控因素做了诸多研究，发现DNA甲基化及组蛋白修饰等均可参与肿瘤细胞EMT的发生发展，但mRNA修饰对肿瘤细胞EMT的影响尚未揭示。 研究结果： 一、癌细胞中EMT受mRNA的甲基化水平调控 作者从多个角度验证分析了EMT受mRNA的甲基化水平调控，虽然EMT可以被各种细胞外配体诱导，但TGF-β被认为是癌细胞转移过程的主要诱导因子。因此作者用10ng / ml TGF-β处理HeLa和HepG2细胞3天，观察细胞，HeLa和HepG2细胞均分散并呈纤维细胞形态（下图A）。 通过细胞刮擦、TGF-β处理以及Transwell检测发现HeLa和HepG2细胞的伤口愈合（下图B），侵袭能力（下图C）均显着增加；通过qRT-PCR观察到FN1和MMP2 mRNA上调且CDH1（E-Cad）mRNA下调（下图D）。 通过蛋白质印迹分析进一步证实了这些TGF-β诱导的EMT标志物表达的变化（下图E）。 以上所有这些数据表明用TGF-β处理的癌细胞正在进行EMT过程。 然后，作者研究了经历EMT的癌细胞的mRNA中m6A水平的变化。通过LC-MS/MS分析，使用来自同一批次的标准样品的标准曲线计算定量。基于校准曲线计算m6A与A的比率，发现通过TGF-β处理， HeLa和HepG2细胞中m6A水平的mRNA比对照细胞更丰富。 此外，通过斑点印迹分析获得的结果进一步证实了这一点。 类似地，用TGF-β处理的Huh7和A549细胞得到的结果与上述结果一致； 总的来说，这些数据显示经历EMT的癌细胞增加m6A水平的mRNA。 为了证明m6A在EMT过程中的作用，作者使用CRISPR / Cas9编辑系统，在HeLa细胞中敲低METTL3，形成 METTL3Mut/− HeLa细胞。下图是METTL3在野生型及METTL3Mut/− HeLa细胞中的蛋白表达情况。 进一步通过LC-MS/MS分析，结果显示，METTL3 Mut/− HeLa 细胞的m6A水平显着低于野生型细胞，这也证实了METTL3作为mRNA的m6A具有介导催化作用。 得到这个结果后，作者对METTL3Mut/− HeLa 细胞EMT特性进行了评估，依旧使用细胞伤口愈合能力及细胞体外侵袭能力来检测，结果显示：与野生型相比，METTL3Mut/− HeLa 细胞的伤口愈合能力及体外侵袭能力均受到抑制； 使用同样的方法，在Huh7和HepG2细胞中出现类似结果； 此外，作者发现，在METTL3Mut/− HeLa细胞中，MMP2和FN在mRNA和蛋白水平下调，而E-Cad 在mRNA和蛋白水平上调。E-cadherin（由CDH1基因编码）的降低被是EMT发生的基础。 接着，作者在在Huh7和HepG2细胞中进一步验证，通过蛋白质印迹分析证实，敲低METTL3，可降低MMP2和FN，同时增加了E-Cad。
这些数据表明METTL3的缺失可以抑制癌细胞EMT的发生； 作者进一步验证m6A水平在EMT中的作用，作者在HeLa细胞中过表达ALKBH5，它是哺乳动物mRNA37的关键m6A脱甲基酶。数据显示ALKBH5的过表达降低了HeLa细胞中FN和MMP2的mRNA。
进一步通过蛋白质印迹分析显示ALKBH5的过表达增加了E-Cad，同时降低了HeLa细胞中的MMP2和FN。
此外，在METTL3Mut/−HeLa和Mett13敲低的Huh7细胞中恢复了由TGF-β诱导的E-Cad下调和FN上调。
根据上述数据已经知道METTL3的缺失可以抑制癌细胞EMT的发生，作者进一步研究了METTL3的临床作用。TCGA数据显示，METTL3在肝癌组织中的表达显着高于癌旁组织。
在364名肝癌患者中，METTL3的表达与CDH1 mRNA呈负相关。这种关联与上述数据呈现结果一致 。
根据Bertero等的报道，TGF-β可通过Smad2 / 3与METTL3-METTL14- WTAP复合物之间的相互作用诱导人胚胎干细胞（hESCs）中的mRNA甲基化。通过使用Smad2 / 3抑制剂B431542（10μM）预处理HeLa细胞，然后用TGF-β进一步处理3天，通过LC-MS/MS测定总mRNA的m6A 与A的比例，来计算m6A在mRNA上整体的甲基化程度。发现Smad2/3抑制剂SB431542（SB）可以阻碍TGF-β诱导的HeLa细胞中m6A的上调。
根据以上数据，可表明：mRNA中的总m6A水平可以促进癌细胞的EMT。 二、EMT的细胞，m6A会调控其它基因的变化 为了研究在m6A修饰在特定基因中的变化，作者通过m6A测序，定位了进行EMT的HeLa细胞的m6A甲基化组，发现：GGAC motif在对照和EMT细胞中的m6A位点内高度富集，另外，m6A的峰主要出现在起始密码子和终止密码子附近。
作者利用m6A-seq结果进一步分析了mRNA的总m6A分布情况。 观察到对照和EMT细胞中总m6A分布的类似， m6A峰主要富集外显子区域；
接着作者将对照与EMT细胞进行比较，共鉴定了128个基因，结果发现在表达水平上，EMT细胞的m6A是对照的1.5倍。 这128个基因GO富集分析表明，少数基因与经历EMT的癌细胞中的黏附连接以及肌动蛋白细胞骨架的形成有关。
总的来说，m6A-seq数据显示m6A修饰发生在EMT期间与细胞连接，粘附和迁移相关的少数基因上。 三、Sainl参与癌细胞中m6A水平调节EMT 为了验证Sainl是参与m6A调节的癌细胞EMT的潜在靶点，作者通过在EMT期间鉴定84个EMT的相关基因和61 个m6A调节基因（大于2倍m6A变化），最终确定了四个重叠基因。分别为SANI1、CTGF、MSN、CTNNB1，在四种鉴定的基因中，Snail被认为是控制EMT的重要转录因子。作者的数据证实Sainl mRNA被m6A修饰，并且在EMT进展期间在CDS和3'UTR区域中m6A的显着富集，另外，作者通过RIP技术，发现在EMT细胞中，m6A水平的Sainl-mRNA显著增加，富集倍数与对照相比约为2.3倍。
接下来，作者研究了在HeLa细胞中敲低METTL3、以及过表达ALKBH5时Snail蛋白的表达情况，。在METTL3缺失和ALKBH5过表达的两种情况下，作者观察到HeLa和HepG2细胞中Snail蛋白水平的降低而ZEB1表达没有变化。
为了证实m6A对Snail表达有作用，作者用TGF-β处理野生型和METTL3Mut /-HeLa细胞。结果显示，在METTL3Mut /-HeLa细胞中，TGF-β诱导的Snail表达低于对照细胞，这表明m6A参与TGF-β诱导的癌细胞中Snail的表达。
作者进一步研究了Snail在m6A触发的癌细胞EMT中的作用，Snail的过表达，会使HeLa细胞中由于METTL3缺失而减弱伤口愈合受到抑制。
同样的，METTL3Mut /-HeLa细胞中，Snail的过表达抑制了FN的下调和E-Cad的上调。
这些数据表明，Snail参与癌细胞中m6A调节的EMT。 四、m6A促进癌细胞中Snail mRNA的翻译 作者进一步研究m6A甲基化调节Snail表达的机制。首先，作者检测了Snail的pre-mRNA和mat-mRNA的表达。令人惊讶的是，在敲低METTL3的细胞中Snail的pre-mRNA和mat-mRNA的表达都显着增强。然而，野生型和敲低METTL3的细胞中的启动子活性没有差异，表明Snail的转录不受m6A的影响。
接着作者通过分离细胞核和细胞质的RNA，发现野生型和敲低METTL3的细胞之间Snail mRNA的亚细胞定位没有差异。
用Act-D处理野生型和METTL3Mut /-HeLa细胞以阻断转录。结果显示野生型细胞中pre-mRNA和mat-mRNA的半衰期显着短于METTL3Mut /-HeLa 细胞。表明m6A修饰可能引发pre-mRNA的剪切和癌细胞中Snail mat-mRNA的降解。
另外作者补充证实，Snail是YTHDF2的靶标，其负责m6A介导的转录物的mRNA去稳定化。过量表达YTHDF2可降低HeLa细胞中成熟Snail mRNA的表达和稳定性；
然后，假设METTL3Mut /-HeLa细胞中Snail蛋白的下调可能是由于蛋白质稳定性或翻译效率引起的。为了证实这一点，用蛋白翻译抑制剂CHX处理野生型和METTL3Mut /-HeLa细胞。 通过Wester-blot印迹分析的结果显示，野生型和METTL3Mut /-HeLa细胞之间Snail蛋白的半衰期相似；
这表明m6A诱导的Snail表达与蛋白稳定性无关。 此外，作者用MG132预处理METTL3Mut /-HeLa细胞以抑制蛋白体外酶活性和使用CHX阻断蛋白翻译，然后用TGF-β处理。结果数据显示，在CHX而非MG132存在下， TGF-β诱导的METTL3Mut /-HeLa细胞中的Snail表达减弱。
随后作者将Snail CDS连接到多克隆位点（MCS）构建了pmirGLO-Snail荧光素酶报告基因。 双荧光素酶测定显示，Snail在METTL3Mut /-HeLa细胞中的翻译效率显着低于野生型细胞。
表明m6A诱导的Snail表达与翻译调控有关。 下面作者对RNA进行分类，通过多聚核糖体分析，发现METTL3Mut /-HeLa细胞中80S的核糖单体和多聚核糖体都低于野生型细胞。
另外，qRT-PCR显示：METTL3Mut /-HeLa细胞中转录活跃的多核糖体（> 80S）中的Snail mRNA显着低于野生型细胞。
作者在EMT细胞与野生型细胞中进行多聚核糖体分析，发现二者相似。 值得注意的是， EMT的癌细胞的多聚核糖体（> 80S）中SNAI1 mRNA增加；
五、SNAI1 CDS区域中的m6A是表达调控的主要位置 作者通过对m6A-RIP测序，数据显示CDS区域中m6A峰值位于第20条染色体上，48,600,490 to 48,600,630且在3 'UTR。
作者鉴定了3个GGAC motif，分别位于CDS区域和Snail mRNA的3'UTR区域；
这个结果与m6A RIP-seq鉴定的峰的位置和量是一致的。然后通过免疫沉淀法收集片段化RNA进一步验证，发现CDS区域中的m6A甲基化可能比3'UTR中的m6A甲基化更具动态； 下面作者对m6A甲基化对SNAI13'UTR及CDS区域分别作了详细研究。 首先，作者为了研究m6A甲基化对SNAI1 3'UTR区的潜在作用，作者再次构建荧光素酶报告基因，分别为：WT-3’UTR、MUT1-3’UTR、MUT2-3’UTR。 结果发现，与对照细胞的翻译没有差异。
这表明3'UTR上的m6A甲基化可能不参与m6A修饰调节的Snail表达； 然后作者研究了CDS区域的m6A甲基化是否可以调节Snail的表达。首先，生成一个仅包含Snail CDS的表达式构建体。与pcDNA / ZEB1共转染Snail CDS，其表达不受m6A甲基化调节，以保证转染效率正常。结果显示，METTL3Mut细胞中Snail的表达显着降低，而ZEB1的表达未受影响，表明CDS中的m6A甲基化与m6A介导的Snail表达密切相关。其次，作者将m6A的GGAC motif突变为GGCC（CDS-mut1）。将附近的GGAA突变为GGCA用于比较（CDS- mut2）。
总之，结果数据表明SNAI1 CDS区域中的m6A是表达调控的主要位置； 我们知道，YTHDF1作为RNA甲基化的读取器，具有识别m6A mRNA的功能。作者对YTHDF1是否参与SNAI1 mRNA的m6A甲基化进行了验证。利用RIP-PCR技术，发现YTHDF1显着富含SNAI1 mRNA，而这种相对富集在METTL3Mut 细胞中被抑制。并且YTHDF1主要与SNAI1 的CDS区域相互作用；
为了进一步验证这个结果，作者在HeLa细胞中敲低了YTHDF1的表达，结果发现HeLa细胞中由TGF-β诱导的Snail表达也降低了;
由于真核生物的翻译延伸是由两个延伸因子作用进行的，：eEF-1和eEF-2，作者观察了MetE13Mut -HeLa细胞中eEF-1和eEF-2结合Snail mRNA的变异。数据显示，在METTL3Mut-HeLa细胞中Snail mRNA和eEF-2之间的结合显着低于HeLa细胞中的结合。 此外，通过蛋白定性分析表明，得到了类似的结果。
这些数据统一表明YTHDF1和eEF-2可能是m6A诱导的癌细胞中Snail mRNA翻译延伸的因素。 六、m6A与癌细胞发展有关 作者用了三个动物群组来研究m6A甲基化对癌细胞转移的潜在影响。 首先，将sh-control和sh-METTL3 Huh7细胞皮下注射到裸雌性小鼠中。 当肿瘤体积为每组约100mm 3时，杀死小鼠。 IHC结果显示，METTL3的降低，导致异种移植肿瘤组织中Snail，FN和Vim的表达水平下降，这表明当肿瘤体积约100mm3时，METTL3的敲低可降低Huh7细胞的EMT和Snail表达。
为了进一步确定m6A甲基化对体内转移的影响，分别对BALB/c裸鼠进行尾静脉注射。注射后8周，对转移性肿瘤进行分析。与对照细胞相比，来自sh-METTL3 Huh7细胞的肺肿瘤的数量显着减少，表明METTL3的下调可抑制体内肿瘤转移。
进一步研究Snail是否参与m6A调节的体内转移，将HeLa WT，METTL3Mut /- HeLa，HeLaSnail和Mettl-Mut /- HeLaSnail细胞尾静脉注射到裸鼠中。体内数据显示，与HeLa WT细胞相比，源自METTL3Mut /- HeLa细胞的肺肿瘤数量显着减少；然而，过量表达Snail会减弱METTL3Mut /- HeLa细胞对体内转移性肿瘤的抑制作用；
这表明Snail参与了METTL3的体内转移作用。 目前数据已经可以证明敲低METTL3，可以降低Snail的表达，以及HepG2 和 Huh7 细胞的体外侵袭和EMT，然后作者研究了m6A与临床开发有何联系？肝癌组织与癌旁组织相比，在肝癌组织中METTL3和YTHDF1的表达上调；且肝癌肿瘤组织的T1至T4期，YTHDF1表达水平显着升高；
此外，YTHDF1的表达与肝癌癌症患者中的SNAI1 mRNA正相关。另外观察到METTL3从正常肝脏到肝硬化再到肝癌组织中表达水平持续上升。
作者使用组织微阵列检查了100例肝癌组织中的蛋白质表达。IHC分析证实，在测量的100个肝癌中，METTL3的表达与Snail的表达正相关。
最终，作者证实METTL3、YTHDF1、Snail表达增加的肝癌患者，总体存活率降低。
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