 研究背景 母亲节刚过，您的妈妈和身为妈妈的您是否又为熊孩子增添了一绺白发。朋友圈的亲，有没有对妈妈说声辛苦了？还有啊！要像周董歌里唱的听妈妈的话！今天小编就用近来发表在顶级期刊上的文章，来看看兢兢业业的科学家们为乳腺癌的研究下了哪些功夫。 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率位居女性恶性肿瘤的首位，严重危害妇女的身心健康。乳腺癌分子分型为三种：三阴乳腺癌（TNBC），luminal型和HER-2（+）型。化疗和放疗是乳腺癌的首选治疗手段，这些药物的潜在免疫原性成分使它们成为新辅助治疗的有吸引力的候选药物。除此之外，免疫治疗是目前针对包括乳腺癌在内的肿瘤研究最多，临床发展最快的一种疗法。基于免疫效应细胞的免疫治疗目的是针对肿瘤细胞表面的异常抗原，帮助身体抵御癌症。PD-1/PD-L1免疫抑制剂是通过肿瘤细胞和T细胞结合，恢复或增强自身免疫能力来清除癌细胞。其作用原理如下图所示：  研究背景 肿瘤微环境（Tumor Microenvironments）是指肿瘤细胞存在的周围环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤免疫微环境中免疫细胞浸润并分泌炎性介质，形成炎性微环境，这一微环境有助于肿瘤异质性。肿瘤微环境中的免疫细胞负责为肿瘤患者开启机体免疫应答。免疫细胞成分复杂多样，主要包括T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和抗原提呈细胞等。浸润在肿瘤局部的淋巴细胞通常称为肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。在与肿瘤细胞的相互影响中，以调节性T细胞（Treg）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）为代表的肿瘤免疫微环境组分介导了免疫抑制。肿瘤微环境里面的成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等基质细胞，不仅为肿瘤的发生发展提供保护和支持，而且主动参与到肿瘤进程。肿瘤微环境与肿瘤细胞相互作用，共同介导了肿瘤的免疫受耐，从而影响了免疫治疗的临床效果。此外，由于肿瘤微环境中存在大量免疫抑制性细胞，针对这些细胞进行肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗的新策略。 针对肿瘤微环境各种细胞类型的单细胞转录组测序技术能够对肿瘤组织的细胞类型进行精细分类，基于异质性而个性化定义细胞亚群的组成、分布、功能和发展状态，同时还可以发现新的细胞亚群。研究界普遍认为数量多的免疫细胞CD3+ T细胞的存在代表了更强的抗原体验、抗肿瘤免疫反应。原发和转移性乳腺癌中肿瘤浸润型淋巴细胞（TILs）含量水平较高与更好的预后相关，因此TILs的数量可以预测早期三阴乳腺癌，三阴乳腺癌是免疫治疗针对的主要亚型，具有最高的乳腺癌亚型突变负担，最有可能产生肿瘤新抗原。 研究内容 下面分享一篇2018年发表的顶级期刊论文，一起来看看科学家利用单细胞转录组测序技术在揭示乳腺癌肿瘤微环境复杂性和未来靶向免疫抑制细胞免疫治疗方面做了哪些工作。 来自一项国际合作项目的研究团队在Nature Medicine发表了题为Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset associated with improved prognosis的论文。 首先三个比较重要的现象是：在三种乳腺癌亚型中，原发部位肿瘤浸润型免疫细胞的数目（TILS）多于转移部位（图1）；在此案例中CD3+ T细胞是最主要的肿瘤浸润免疫细胞（图2）；CD3+ TILs的高百分比与CD4:CD8比值的显著降低有关（图3）。  这一观察结果与高含量的CD3+ T细胞的存在代表了更强的抗原体验、抗肿瘤免疫反应相一致，原发和转移性BCs中TIL水平较高与更好的预后相关。 迄今为止，免疫检查点阻断抑制剂(CBI)对BC患者的疗效并不明显。然而，据报道，对pembrolizumab和atezolizumab较高的应答率与晚期三阴乳腺癌患者体内TILs的数量有关。为了研究清楚人类原发性三阴乳腺癌的T细胞异质性，研究者对两例人原发性TNBC肿瘤新分离的6311个利用流式分选CD3+CD45+ T细胞进行了3’mRNA单细胞转录组测序分析。根据基因表达量，共鉴定出10个细胞亚群（图4）。其中一个亚群Treg高水平表达CCR8，另外一个亚群CD8A+CD103+具有类似组织原位记忆TRM的细胞表型。在这个TRM细胞亚群中有400个基因差异表达，包括一些TRM分化的标志分子，以及组织中保留TRM细胞所必需的分子。一些免疫检查点也呈现高表达的趋势，包括TIM3，PD1，CTLA4，TIGIT，LAG3，GZMB和PRF1等。利用拟时序分析发现，TRM和TEM处于分化的两端，位于这两群细胞中的基因表达也呈现相反的状态（图5）。研究者还注意到另外一组CD8A+CD103+细胞亚群具有有丝分裂特征，同时与增殖有关的基因的高表达。这个细胞群位于TRM簇旁的拟时间路径上，与CD8+ TRM细胞群正在积极进行细胞分裂一致。通过单细胞转录组分析，研究者很明确的指出CD8+T细胞在不同的细胞亚群中具有异质性。CD8+TRM亚群表达细胞效应蛋白和众多免疫检查点，在免疫微环境中保持细胞高分裂活性，这对免疫制剂的临床开发具有重要意义。  研究者还注意到在CD8+T细胞中高水平表达CD103，在免疫检查点方面，高百分含量的CD8+CD103+ T细胞表达PD-1（图6）。  为确认人乳腺癌中CD103+CD8+T细胞类似于TRM -like集群中观察到单细胞的数据,研究者利用流氏细胞仪分选到CD8+CD103+和CD8+CD103- 两类T细胞进行RNA-seq。其样品来自于三个病人的新鲜肿瘤(两个原发肿瘤和一个TNBC肝转移)。转录组测序鉴定出534个差异基因，在CD8+CD103+细胞中组织出口基因SIPR1和KLF2显著下调表达，而免疫检查点PD1和CTLA4显著上调。火山图和热图数据分析表明，差异表达的基因在bulk RNA-seq和单细胞测序的特征一致（图7）。研究数据表明，在乳腺癌中 CD8+CD103+ T细胞表现出与TRM分化一致的特征，并证实存有较多TILs的乳腺癌中存在大量CD8+CD103+ TRM样细胞，这表现为一个明显的细胞子集。另外，从功能上表明CD8+CD103+的细胞毒性和促炎潜能。TRM细胞表现出克隆扩增，这通常与抗原识别相关，并且它们的抗原特异性可能来自于在正常、肿瘤前和早期肿瘤乳腺组织中驻留期间所经历的不同微环境。  研究者的数据表明CD8+CD103+ TRM细胞亚群在原发性三阴乳腺癌的肿瘤微环境中是一个高度密集的效应群体，如此预测来自TRM单细胞亚群的基因表达特征将提供重要的预后信息。 利用来自“METABRIC”的现有基因表达数据，在329例原发性三阴乳腺癌中，研究者发现TRM基因表达特征同化疗后无复发情况和总体生存率的改善显著相关。进一步的分析发现TRM表达特征可以用来区别CD8高水平表达的患者预后好或预后差不同情况（图8）， CD8+ TRM细胞可能是含有较多肿瘤浸润淋巴细胞的乳腺癌病人临床疗效改善的关键点。  研究结论 综上，本研究利用单细胞转录组测序技术把肿瘤微环境中的细胞分为10个亚群，并发现CD8+ TRM细胞这一细胞亚群高水平表达免疫检查点和效应蛋白，这与乳腺癌患者的良好的预后显著相关。  伯豪生物经过6年的积累，基于SMART-seq技术，对来源于人、小鼠、大鼠、果蝇、斑马鱼、牛、羊等物种的样本提供了单细胞测序服务，研究成果发表在Cell Research、Nature Neuroscience等杂志上。  |
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