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自体CD19CAR-T已经在急性淋巴母细胞白血病，非霍奇金淋巴瘤临床治疗上取得了成功，这就预示着CAR-T治疗或许是包括多发性淋巴瘤在内的恶性血液病最有希望的治疗方案。然而，自体CAR-T由于制备所需要时间，制备条件等多方面的制约因素限制了其在临床上的广泛应用。同种异体CAR-T(AlloCAR-T)有望克服自体CAR-T面临的困难，使CAR-T治疗获得广泛应用。不同于自体CAR-T的是AlloCART使用健康人的T细胞，可以实现规模化生产，设计针对肿瘤表面特异性抗原的CAR,利用基因工程敲除TCR,使TCR介导的免疫反应受限。本文展示了利用TALEN（转录激活因子样效应物核酸酶编辑技术）编辑的针对B细胞成熟抗原（BCMA）CAR-T，使CAR-T具有淋巴细胞删除耐受，和免疫排斥反应很弱的潜能。为了安全起见，AlloBCMA CAR-T还增加了rituximab识别表位为基础的分子开关，使得AlloBCMA CAR-T在有rituximab存在时及时有效的被清除。在小鼠模型上观察到，当添加相应的人源细胞因子时AlloBCMA CAR-T持续的抗肿瘤效果，最重要的是，在规模化生产过程中保持着相应的表型和效能。这一成熟的AlloBCMA CAR-T制备技术平台是CAR-T广泛开展临床治疗的希望。 CAR-T治疗已经在恶性血液病治疗方面取得了长足的进步，已有两种CD19CAR-T获得FDA批准用于B淋巴细胞恶性疾病。由于患者年龄的限制，接受CAR-T治疗前的经历的其他各种各样的治疗，以及疾病本身限制了患者自身的T细胞数量和质量，也影响着自体CAR-T产品的效能和批间差异。另外，以患者T细胞来源的CAR-T产品在生产过程中需要强大的后勤保障，以健康人T细胞来源的同种异体CAR-T用现成的健康供体T细胞为原料迅速产品化，可以有效规避自体CAR-T制备过程中遇到的各种不便。同种异体CAR-T（AlloCAR T ）可实现产品的批量化生产，一次制备可以满足多个病人同时治疗，且多余产品可以保存待用，CD19Allo CAR T 的制备给急性淋巴性白血病患者带来了希望，这一产品已经在欧洲和美国展开临床试验。 多发性骨髓林属于B淋巴细胞恶性疾病，常见于老年患者中，平均发病年龄约70岁。尽管化疗，蛋白酶抑制剂药物，免疫检查点抑制分子，自体干细胞移植等治疗方法已经在该领域治疗取得了很大发展，但是该病仍属于不治之症，绝大多数患者后期复发。B细胞成熟抗原（BCMA）属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族，又被称为TNFRSF17或CD269,表达于成熟B细胞和浆细胞表面，而且它也表达于多种髓性瘤细胞发展的各个阶段。靶向BCMA治疗的有效性已经在临床前和临床试验中得到证实，多个研究小组已经在进行多个AlloCAR T 治疗BCMA+的恶性血液肿瘤。本文论述了针对BCMA全人源CAR修饰的CAR-T在多发性骨髓瘤体内外模型的靶向性和有效性。更为有趣的是我们在CAR的胞内段加上了可被利妥昔单抗诱导的分子开关，体内外实验证实，分子开关的加入在不影响CAR-T的功能的前提下，使得该CAR-T更加安全，方便了CAR-T在紧急情况下的清除。利用TALEN技术编辑的AlloBCMA CAR-T有效降低了移植免疫排斥带来的风险，以及保留了对CD52抗体介导的淋巴清除的耐受。在NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠输注了AlloBCMA CAR-T后，小鼠体内反应与体外实验一致，而且当小鼠体内存在生理状态下浓度的IL-17,IL-15时，极大提高了AlloBCMA CAR-T抗肿瘤的持续性和有效性。总之，所有数据都支持了AlloBCMA CAR-T是多发性骨髓瘤治疗的新希望。 1.制备BCMACAR-T的候选物 针对BCMA的CAR来自于全人源抗体库，利用噬菌体文库筛选，克隆成熟等技术筛选到针对BCMA亲和力覆盖范围在0.038-5.57nM的3个候选单链抗体片段scFvBCMA1,2,3，并以此为基础来设计CAR的结构。scFv插入到CAR的骨架区，胞膜外铰链区，跨膜区由CD8α受体来提供，胞内区融合了4-1BB共刺激分子和CD3-ε激活结构域。利用核糖体跳跃识别多肽使载体共表达了蓝色荧光蛋白或可供利妥昔单抗识别的多肽RQR8序列和可供CD34抗体Qbend10识别的1个结构域。scFv来源于已公布的序列且结合特性与阳性对照相同。 2.候选BCMACAR-T展示了良好的靶点依赖性细胞因子释放 异源CAR-T源于对健康人的T细胞修饰，流式细胞术检测CAR-T高表达CAR（如图1.A）。有报道称CAR高表达以及scFv诱导的CAR聚集，可以导致CAR无关的T细胞激活,加速T细胞分化，降低长效抗肿瘤效力。释放IFN-γ的CAR-T被看成是激活的T细胞替代品。T细胞在缺少靶分子的情况下也会自发地释放一些IFN-γ。然而，在有表达BCMA的细胞MM.1S细胞存在时，IFN-γ释放显著性提高。流式细胞分析CD45RO和CD62L表达情况，结果显示在候选CAR-T细胞群具有类似的记忆细胞和效应细胞比例(如图1B.C)。 3.候选BCMA CAR-T保留着效应功能，体内实验显示强有力的抗肿瘤作用 通过细胞毒性实验对候选CAR-T在BCMA高水平和低水平层面上（图1D-1F）的短期（24h）和长期（7Day）(图1G-1I)杀伤作用进行评估。在短期实验中，候选CAR-T对BCMA阴性的REH细胞没有影响，未见到细胞毒性，但是对转染BCMA过表达的REH细胞表现出了强烈的剂量依赖细胞毒性。而且在内源性高表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞MM.1S细胞上面也同样看到了强烈的剂量依赖细胞毒性（如图11D-1F）。所有候选CAR-T变现出了同等水平的杀伤作用。维持CAR-T的细胞毒性，保持CAR-T的增殖能力有助于CAR-T对肿瘤细胞保持长期杀伤作用从而达到持续抗肿瘤的目的。长效实验评估中所有CAR-T都表现出了非常可观的抗肿瘤效果（如图1G-1I）。值得注意的是，一些供体的T细胞无论表达何种特异性CAR结构，均表现出较强的增殖和细胞毒性，而其他一些供体的T细胞在表达BCMA2或BCMA3时或增殖失败或细胞毒性较低。 图1.BCMACAR-T有高水平的增殖和抗肿瘤活性 4.具有胞内CAR开关的BCMA CAR-T更好的保持记忆细胞亚群和抗肿瘤活性 已经有一系列关于CAR-T自杀基因的相关报道，这些自杀基因可以通过商业化抗体针对性检测和清除CAR-T，有文献报道了RQR8多肽表达跟CAR并不匹配，因此，最新的文献报道是将rituximab识别结构域直接整合进CAR,对不同而构象进行测试，最后筛选到一种结构在scFV和铰链区含有两个rituximab识别位点的BCMA1-R2 CART。BCMA1(RQR8)和BCMA1-R2 有同等的转导效率（如图2A）和类似的记忆细胞表型保持率（图2B-2C）。在短期毒性试验测试中BCMA1CAR-T 和BCMA1-R2CAR-T相对于靶细胞有类似的细胞毒性（如图2D-2F）。在长期的毒性试验中也是如此（如图2G-2I），而且二者具有类似的靶点依赖增殖活性(如图2J)。在多发性骨髓瘤原位癌模型并排实验中，BCMA1CAR-T 和BCMA1-R2CAR-T并没有明显的不同，只是在反应动力学上略有不同。 由于多发性骨髓瘤细胞表面的BCMA容易被剪切掉，我们检测了在有可溶性的BCMA存在时，是否会对BCMA1CAR-T 和BCMA1-R2CAR-T产生影响，结果显示当游离BCMA的浓度从100ng/ml增加到400ng/ml时BCMA1CAR-T 和BCMA1-R2CAR-T的细胞毒性只会略微降低。我们也检测了在有rituximab存在时，与BCMA1-R2CAR结合，诱导CAR聚集，导致T细胞激活以及引起激活诱导的细胞凋亡。BCMA1-R2CAR-T在含有不同浓度rituximab的培养基中培养24h,未见到激活标志物4-1BB的变化，未见到T细胞组成的变化，即使在培养基中rituximab浓度达到100μg/ml,也未见凋亡细胞的增加。与上述结果一致的是在有rituximab存在时，IFN-γ的分泌也没有增加，以上试验表明，给CAR-T加上分子开关并没有改变CAR-T的表型和活性。 图2.胞内分子开关的加入不影响BCMACAR-T的活性 5.体内外实验证实分子开关有助于CAR-T细胞清除 胞内CAR分子开关的功能依赖于rituximab特异性的识别和高亲和力的结合与相关表位。尽管在用抗BCMACAR( scFV)染色时，BCMA1CAR-T 和BCMA1-R2CAR-T染色几乎处于同等水平，然而在用rituximab染色时BCMA1-R2CAR-T染色占比44.3%，而BCMA1CAR-T 只有27.6%（如图3A）。在补体依赖的细胞毒性试验（CDC）中,rituximab对BCMA1-R2CAR-T识别的相应提高与BCMA1-R2CAR-T被清除的数量息息相关（如图3B）。细胞存活实验显示存活下来的细胞是那些CAR表达量低得细胞（如图3C和3D）,这就意味着CAR的表达水平与被清除的水平相关。在rituximab处理后BCMA1-R2CAR-T 抗肿瘤活性完全被抑制，而且在rituximab处理后外周血中BCMA1-R2CAR-T循环非常之低（如图3E和3F）。 图3.胞内分子开关有助于在rituximab存在时有效清除BCMACAR-T 6.破坏TRAC和CD52有助于异基因治疗而不影响T细胞功能 临床前和临床试验已经证实淋巴细胞耗竭可以减少免疫抑制细胞的干扰，有利于提高过继T细胞的效率，有利于T细胞在高水平平衡因子的条件下扩增，也有利于降低抗CAR-T的免疫反应。对于异体细胞治疗来说，淋巴细胞清除显得尤为关键，它可以延迟机体对异体产物的排斥。CD52广泛的表达于免疫细胞表面，抗CD52抗体alemtuzumab是临床上常用语免疫细胞清除的药物。与此一致的是TALEN介导的TRAC和CD52的敲除有降低抑制免疫反应的潜能，赋予CD19CAR-T对alemtuzumab产生耐药性，于是存在这样的潜能，用alemtuzumab持续清除淋巴细胞以保证CAR-T的持续功能。 运用TALEN技术，使BCMA1-R2CAR-T有效敲除了TRAC和CD52,（如图4A）利用磁力分离去除TCRα+细胞，在洗脱液里剩下不到3%的CD3+细胞，提供CD3-CD52-足够纯的CAR-T细胞用于研究（如图4A.B）。结果显示，纯化的CAR-T对CD52抗体诱导的CDC产生了耐药（如图4C）。与野生对照相比，基因编辑的CAR-T没有影响T细胞的表型，而且基因敲除并没有影响BCMA1-R2CAR-T的细胞毒性（如图4E），为了探讨CD52敲除在体内有可能发生的结果，TCR/CD52双敲除和TCR敲除的CAR-T以次优剂量输注，与体外实验结果一致，双基因敲除并没有改变CAR-T的抗肿瘤活性（如图4F）。 图4.基因编辑BCMACAR-T使CAR-T对CD52抗体产生耐药且不影响CAR-T活性 7.BCMA1-R2CAR-T 在小鼠体内表现出持续的抗肿瘤作用和维持细胞增殖的平衡细胞因子 如前面所述候选CAR-T一样，BCMA1-R2CAR-T在体内显示剂量依赖的抗肿瘤作用，但大多数供体病情出现了复发（如图5A）。CAR-T血液中动力学测定发现其扩增受到限制，血液中维持时间很短（如图5B）。给复发小鼠再一次注射CAR-T时，表现出强烈的抗肿瘤作用和戏剧性的转变，那些存活时间短的CAR-T开始扩增（如图5D）。这一结果表明，最初的长效CAR-T的失败不能归咎于肿瘤细胞与CAR-T在区域位置上的隔离，CAR-T难以到达肿瘤部位，也不能归咎于肿瘤细胞表面BCMA的下调，可能要归咎于长效CAR-T较少或/和CAR-T的活性较低。 平衡细胞因子IL-17和IL15是人类T细胞存活和发挥功能所必需的，临床上二者的浓度与CAR-T治疗息息相关。为了评估二者对CAR-T存活和发挥细胞功能的作用，野生型荧光素酶标记的BCMACAR -Ts在动物身上进行了试验，并添加了重组人细胞因子，这些细胞因子由抗体或受体片段可结晶(Fc)融合蛋白稳定。IL-15与IL17相比，以更强的作用使CAR-T扩增，显示了强烈的抗肿瘤作用。为了探究生理状态下细胞因子浓度对CAR-T的影响，重组表达人IL-17,IL15/IL15Rα的腺相关病毒复合物注射NSG小鼠。腺相关病毒9（AAV9）注射小鼠表现出稳定的细胞因子表达，在生理状态下的IL17,IL15使异体BCMA1-R2CAR-T表现出持续的抗肿瘤作用。（如图5E）在外周血中伴随着CAR-T的增殖和长期的CAR-T细胞存活（如图5F）。为了进一步证实这一发现，另外两种BCMACAR-T候选物BCMA4-R2 CAR-T ,BCMA 5-R2CAR-T通过体内外实验已经证实有合适的表型和高有效性。在存在IL-17,IL15两类细胞因子时，BCMA4-R2 CAR-T ,BCMA 5-R2 CAR-T增强了相应的抗肿瘤作用，尤其是BCMA5-R2 CAR-T表现出更强和更长时间的抗肿瘤作用（如图5G），基于以上强烈的抗肿瘤作用，BCMA1-R2 CAR-T，BCMA5-R2 CAR-T被选作进一步验证BCMACAR-T临床抗肿瘤效果。结果显示，二者都有完全缓解病情的抗肿瘤作用，它们有同等的短期和长期抗肿瘤作用。总之，BCMA1-R2 CAR-T，BCMA5-R2 CAR-T有光明的临床应用前景。 图5.平衡细胞因子有助于提高BCMACAR-T在NSG小鼠体内的抗肿瘤活性和持久性 8.大规模制备AlloBCMA CAR-T,保持细胞表型和抗肿瘤活性 规模化生产是CAR-T走向临床治疗的关键一步，类似GMP标准化规模化制备临床级别的BCMACAR-T需要对其细胞表型和抗肿瘤作用进行评估（如图6A）。激活的T细胞可以被慢病毒高效转导，并且在生物反应器里实现大量扩增（如图6B,C），利用TALEN编辑技术使TRAC和CD52失活，再通过磁力分选去除TCRα+的细胞，剩余超过50%的CAR-T具有干细胞记忆和中央记忆细胞的表型（如图6D）。进一步体外试验显示，大规模制备的BCMACAR-T具有剂量依赖的细胞毒性（如图6F）。因此，我们可以得出这样的结论，在类似GMP的条件下，可以大规模生产具有治疗潜力的异体BCMACAR Ts。 图6.规模化制备临床级别有活性的AlloBCMA CAR-T 本文报道了一个AlloBCMA CAR-T规模化生产的平台的开发。AlloBCMA CAR-T经历了制备可操作性，无靶分子条件下的激活，体内体外的长效细胞毒性等等评估，所有的五种候选BCMACAR-T都有高增殖活性和维持长效细胞毒性特性。患者自体CAR-T相对于健康异体CAR-T应用有相对减少的趋势。在CAR-T制备开始，供体细胞中有强大记忆细胞池时CAR-T的增殖和细胞毒性作用更为明显。这就说明即便是健康供体其T细胞也存在着差异。因为一些供体发生的少数CAR的自激活就会表现出强烈的副作用，因此在CAR异质性选择上也要格外小心，以确保批次之间的差异较小。 同一病毒载体对多个基因的共表达可显著降低产物的转导效率和可制造性，而自杀基因的共表达可能不尽相同。在CAR的结构里融入分子开关可以解决很多障碍。本文在CAR里融入了rituximab结合结构域，可以使用FDA获准的药物实现CAR-T的清除，分子开关并没有改变CAR-T的功能，rituximab诱导的CAR-T清除也得到了证实，我们发现CAR的表达水平和rituximab诱导的CDC正相关。很可能rituximab与BCMACAR-T结合效率低导致了靠CDC清除CAR-T的效率降低，这就类似于靠抗体依赖的细胞毒属性杀伤CD20低表达的细胞一样，同样的杀伤作用较弱。异体CAR-T有望解决自体CAR-T制备阶段的各种限制，但是异体CAR-T容易引起机体TCR与主要组织相容性抗原复合物（MHC）介导的免疫排斥反应，TALEN编辑的异体CD19CAR-T在敲除了TRAC的情况下，有效组织了小鼠体内的免疫排斥反应。因此在异体CAR-T输注前有必要进行淋巴细胞耗竭，同时敲除CD52,使BCMACAR-T对FDA批准的药物alemtuzumab耐药，如果需要更充分的治疗，也允许扩大免疫抑制窗口。 体外实验评估分析可以预测体内功能，尤其是临床前制备阶段对大量候选CAR-T的筛选非常重要。已经证实增殖活性和长效维持与CAR-T临床治疗效果息息相关。在本研究中，通过体外试验评估了多个供体来源的候选CAR-T增殖能力，这一方法也是最初判断CAR-T活性的最佳方法，因为在缺乏细胞因子补充的体内实验未见差异。CAR-T在原位癌中的扩增非常有限，在血液中CAR-T的清除与病情复发一致。IL17和IL15是维持人T细胞存活和增殖的关键平衡细胞因子，而缺乏这些细胞因子的免疫缺陷小鼠体内已经证实会损坏人T细胞功能。如前文所述在有生理状态下所需浓度的IL17,IL15存在时，显著提高CAR-T的抗肿瘤活性和维持CAR-T的长效性。最近使用自体BCMACAR - Ts的临床试验证明CAR- T治疗复发或难治性多发性骨髓瘤的可行性和治疗潜力。大规模生产异体BCMACAR-Ts具有较强的持续抗肿瘤活性，为后续庞大的临床研究需求提供了支持。 原文来源： |
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