转录调控的神器：荧光素酶报告基因实验

果子导读

转录调控是机制研究中很好的方向，里面大部分内容都可以独立完成。

我有几个师妹就是做转录调控的，筛选启动子核心原件以及找转录调控区域是个极其恐怖的操作，要完成100个以上的质粒构建。而我的导师一般会给新入学的同学每人一个基因，就做启动子。他说的是，我们不是要成为实验的工厂，而是启动子的实验会让一个科研人稳定地掌握各种实验技能，完成一整套启动子的实验之后，就可以上手博士的课题了，这是一个traning的过程。

我看过一眼师妹养的细胞，就是那种一眼看过去，恬静的感觉，看不到任何一个杂质。不过她们都已经毕业走了，留都留不住，很惋惜。哪天我联系一下她们，给我们投几篇稿子。

今天，豆子老师给大家带来荧光素酶报告基因实验，先感受一下吧。

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既然我们已经找到了启动子片段，那么接下来肯定想要检测启动子活性，其中我们缺少了启动子构建的过程，下期来分享，这期主要分享如何检测启动子的活性。

荧光素酶报告基因是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，是启动子活性的一种检测方法。

1.原理简述

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL4.0-basic等。
（2）将要检测的转录因子表达质粒或者你认为影响该启动子活性的物质与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达增强。
（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

2.检测方法（Promega试剂盒E1910）

1.第一天晚上，铺48孔板（以Heck293细胞为例），也可以当天早上铺板，下午来转染，细胞铺板时，不要在周边铺板，原因见MTT。
2.待细胞长到70-80%时，对细胞进行转染。

转染方法同前，配置A，B液，在室温静置5min，A液如上配置即可，B液配置时注意，在我们测DNA浓度（即我们构建的启动子质粒）时，就将其调浓度至100ng/ul，同时需要加入P3RLUC来测定海肾荧光，调浓度至20ng/ul，所以B液=15.8ul opti mem + 1.5ul P3RLUC + 2.7ul DNA。

5min后。将A液B液混合，室温静置20min，培养基换为无血清的培养基，20min后加入混合好的液体，转染24h即可。

3.荧光素酶检测准备

1）当刚拿到试剂盒时，了解清楚里面的成分
被动裂解缓冲液制备：用去离子水将5×Passive Lysis Buffer(PLB)裂解缓冲液稀释成1×的，储存在 4℃（≤1 个月），最好现用现配。5×PLB应储存在-20℃。

注：因为荧光素酶活性受温度影响，在定量发光检测过程中Dual-Luciferase荧光素酶缓冲液和Stop & Glo缓冲液应始终保持室温。混合试剂冻存后再次使用，为确保试剂性能，应在低于25℃条件下溶解。溶解后充分混匀，最简单的方法是室温水浴溶解。

LARⅡ：荧火虫荧光素的反应液用Dual-Glo ® Luciferase Buffer溶解冻干粉 Dual-Glo ® Luciferase Substrate，分装，最好多数用1ml的来分装，一个板子基本上就可以够用了，再分装几个500ul，有时候你可能做不到一个板子，这个时候，你也不用去反复冻融，存于-20℃（≤1 个月）或-80℃（≤1 年），最好保存在-80℃。

配置1×Stop & Glo® Reagent：将一定量的 50×Stop & Glo®Substrate 加入到所需要量的Stop & Glo®Buffer中，使终浓度成为 1 倍浓度。（例如，加 0.2ml 的 50×Stop & Glo®Substrate到 10ml 的 Stop & Glo®缓冲液中，制成 1×Stop & Glo®Reagent 溶液。） 此为海肾荧光素的反应液以及荧火虫荧光素的中止液。

2）转染后的细胞，吸去培养液，用预冷的PBS洗涤细胞。

注：荧光酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。

3）加65ul稀释好的裂解液，在摇床上慢速震动30min。
被动裂解
培养板 1×PLB

6 孔 500ul      
12 孔 250ul       
24 孔 100ul       
48 孔 65ul       
96 孔 20ul    


4）在细胞裂解期间，准备足量的1.5 ml灭菌离心管，同时取出所需用量的荧火虫荧光素。计算实验所需要的Dual-Glo ® Stop & Glo ® Reagent的量。用一个新EP管，制备实验所需要要的Dual-Glo ® Stop & Glo ® Reagent量，使用的时候是现用现配。

3.荧光素酶检测

1）重新设定系统：Tools-----Setting-----Reset
2）程序设定：Protocols----Run Promega Protocol---DLR-O-INJ-----OK
3）取细胞裂解液2ul到一个新的EP管，加10ul的LARⅡ，吹打均匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击“Measure”开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。
测量结束后，取出EP管，再加入10ul的Stop & Glo®试剂，吹打均匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测仪上，点击“Measure”开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强度）。
4）记录读数，每个样品会有3个数值：Rlu1--萤火虫荧光素酶反应强度；Rlu2--内参海肾荧光素酶反应强度；Ratio--Rlu1/Rlu2。一般记录Ratio即可，但Rlu1和Rlu2为实际荧光强度。
5）重复测两次。
6）测量完毕后，取出EP管，关闭仪器。

4.注意事项：

1.Dual-Glo ® Luciferase Reagent在室温下能稳定几个小时，8小时后会失去10%的活性，在4℃下48小时会失去10%的活性，反应液可以冻存，以防止其失去活性，但是不要在25摄氏度以上融化，融化后混匀即可。在-20℃下，一周内会失去10%的活性，在-80℃下6个月后会失去10%的活性。
2.Dual-Glo ® Stop & Glo ® Reagent：室温下8小时后会失去8.1%的活性，4℃下24小时后会失去8.5%的活性；通常是现配现用。
3.荧火虫与海肾荧光素酶的推荐使用温度是20-25℃，使用之前要平衡至室温。
4.试剂保存和使用时都应注意避光。