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PiRNA是一类片段大小在26-31nt单链小RNA，大部分集中在29-30nt，5’端具有强烈的单磷酸尿嘧啶核苷酸倾向性，3’端（2ʹ-O- methyl）进行了甲基化修饰（Kirino et al., 2007）(Fig 1)。 Fig 1 structure of piRNA piRNA 生成机制研究进展 已研究的大部分物种中，基因组上散在分布的基因座产生了绝大部分的piRNA，这些基因座被称为piRNA簇（piRNA cluster）。PiRNA 簇根据能否从基因组上的两条链或一条链产生piRNA而分为双链簇和单链簇。单链簇piRNA是分布最广泛的也是默认的类型。单链簇转录生成piRNA前体与经典的转录途径事实上是难以区分的，基于二者都具有以下几个转录特点：（1）启动子区域都有H3K4me2 (histon 3 lysin 4 dimethylation )标志；（2）转录由RNA聚合酶Ⅱ（pol Ⅱ）负责；（3）经典的RNA转录后加工（5’端帽子修饰、剪切、多聚腺苷酸修饰）（Goriaux C et al., 2014）。单链簇转录模式在果蝇中研究的比较清楚。目前，已发现的主要有两个单链簇20A 和 flam （Brennecke J et al., 2007）20A 在体细胞滤泡细胞（somatic follicle cell）和生殖细胞中均表达，flam 只在滤泡细胞中表达。Flam具有几个显著的特点（Fig 2）: (1) 位于常染色质和异染色质的边界；（2）flam中含有gypsy家族的TEs ；(3) 启动子具有H3K4me2标记，簇体具有H3K9me2标记。Flam 的转录需要转录因子Ci (Cubitus interruptus)的参与，piRNA前体的剪切产生多个异构体，这些异构体可以通过UAP56和转运蛋白Nxf1和Nxt1转运到细胞质中的Yb小体进行piRNA的成熟和加工（Fig 3）。 Fig 2 flam cluster in the follicle cells of Drosopbila ovary  Fig 3 the transcription of flam cluster 双链簇是果蝇生殖细胞中piRNA生成的主要方式。顾名思义，piRNA前体可以从基因组的两条链生成。这种方式有别于经典的转录方式，是一种启动子 非依赖的转录方式，并且不需要剪切和多聚腺苷酸形式的加工。多项研究表明，Rhino（特异性的结合到piRNA簇的H3K9me2标记），一种异染色体蛋白1（HP1）的同源物(Yu, B et al., 2015)，是双链簇转录的灵魂蛋白。Rhino被认为是一种“锚”，与Deadlock (Del) 和Cutoff (Cuff) 组成复合物。Rhino-Del 招募Moonshiner 和TATA box 结合蛋白相关因子2（Trf2）到簇的YR元件起始转录(Malone, C. D. et al,2009; Andersen, P. R et al.,2015 )。Rhino-Del-Cuff通过抑制剪切和转录终止来确保簇的转录的不断延伸。转录完成后，piRNA前体通UAP5转运到胞质的nuage区域进行加工（Fig4）。  Fig 4 Fly germline dual-strand clusters’s transcriptions piRNA前体的加工、成熟发生在特定的亚细胞区域，动物生殖细胞中称作nauge，需要PIWI蛋白的参与（Brennecke J et al.,2007; Lim AK et al., 2007 ）。体细胞来源的果蝇卵泡细胞中被所谓的“Yb 小体”替代，位于核膜的胞质一侧（Murota Y et al., 2014; Qi H et al., 2011 ）。依据最新的研究表明，成熟piRNA的生成根据是否依赖于Zuc而分成两种途径，一种是Zuc介导的途径，另一种是Zuc非依赖的生成途径。 核酸内切酶Zuc/MitoPLD，位于线粒体外膜，通过结构及小RNA遗传与生信分析表明。其在piRNA生成途径中的核心地位。Zuc不仅参与到了piRNA 5’端的形成，还直接或间接的参与到3’端的产生（Han, B. W et al., 2015）。随着piRNA簇每隔25nt进行剪切时，果蝇中Zuc的活性表现出一种显著的持续性bi变化。此外，在整个加工过程中PIWI蛋白都参与其中，但是PIWI的加载和Zuc剪切之间的关联还不清楚。 Zuc介导的途径主要由以下两个阶段合作完成：（1）“乒乓循环机制”；（2）Zuc依赖的拖尾piRNA生成途径。“乒乓循环机制”剪切piRNA前体转录本，产生5’ 端单磷酸基团的pre-pre-piRNA，为Zuc依赖的拖尾piRNA生成途径提供底物。“乒乓循环机制”具体过程（Fig 5 ）：（1）Aub结合到piRNA（反义链）形成复合物去识别并剪切转座子mRNA，随后较短的剪切产物被装载到Ago3蛋白，发生剪切并产生Ago3-piRNA（正义链）复合体前体，通过Nbr对3’端进行修饰成熟。成熟的Ago3-piRNA（正义链）复合体识别和剪切piRNA前体转录本，剪切的产物又可以起始新一轮的循环，不断的产生Zuc依赖的拖尾piRNA生成途径的底物。整个循环过程中，特定的复合物（如Vasa、Krimp、Qin、Spn-E）的装载确保剪切产物被装载到不同的PIWI蛋白（Aub/Ago3）上。PiRNA的生成以3’ 方向的形式进行，Zuc以每隔25nt的形式剪切产生拖尾piRNA，该过程中由多个因子参与其中，但是其中的具体机制还不清楚（Fig 5 ）。最后，Hen1 对拖尾piRNA进行修饰产生成熟的piRNA。  Fig 5 Biogenesis of piRNAs by Zuc-dependent pathway Zuc非依赖的piRNA生成途径主要在果蝇的卵巢中发现，哺乳动物和家蚕中很稀有。上文提到，“乒乓循环机制”与Zuc介导的途径共同完成成熟piRNA的产生，事实上，“乒乓循环机制”也可以独立发挥功能。Zuc不存在时，piRNA 5’ 端通过正常的剪切产生，3’ 端通过Nbr去尾修饰（Hayashi R et al., 2016）。秀丽引杆线虫（C.elegans）中不存在“乒乓循环机制”，piRNA (21U-RNAs) 的产生于25-29nt前体，通过前体前两个核苷酸的切除和3’端修饰成熟（Gu W et al., 2012）。 PiRNA 功能研究进展 PiRNA首先在生殖细胞中被发现大量表达，其功能是抑制转座子，维持基因组结构的稳定性。随着体细胞和癌细胞中piRNA的发现，凸显了piRNA功能的多样性和重要性。下文就piRNA已知的几项主要功能进行阐述。 转座子剪切 通过研究piRNA序列发现，生殖系统来源的极大部分piRNA是被从基因间区转录出来的，基因间区序列富集着大量的转座子序列碎片（Gunawardane LS et al., 2007）。PiRNA对转座子剪切功能的实现主要体现在piRNA对反转座子RNA进行识别，识别后利用核酸内切酶活性对转座子进行切割，达到抑制反转座子转座目的。 生殖细胞发育过程中对反转座子进行调控是piRNA的主要功能之一。果蝇的卵泡细胞中，piRNA-PIWI复合物通过识别转座子的初生转录本定位到转录位点，进而招募组蛋白甲基转移酶对H1组蛋白进行H3K9甲基化修饰从而抑制转录（Huang XA et al., 2013）。PiRNA也可以通过诱导DNA发生甲基化而抑制其转座。在小鼠的精细胞中，piRNA-PIWI复合体进入细胞核后识别LINE-1的初生转录本，通过一系列反应引起LINE-1 DNA 发生甲基化抑制其表达（Aravin AA et al., 2008）。大量研究发现，piRNA在其生成过程中伴随着在转录后水平上对转座子的剪切。这一过程主要通过“乒乓循环”生成途径完成（Saito K et al., 2009）。 表观调控 近期研究表明，piRNA途径通过组蛋白修饰和DNA甲基化进行表观调控。果蝇中，PIWI和Aub蛋白被发现是位置效应斑（position-effect variegation）的调控者，提示piRNA途径通过促进染色体的异染色质化沉默基因表达（Pal-Bhadra,M et al., 2004）。在小鼠的配子发生中，卵母和精母细胞阶段PIWI和piRNA集中高表达，而这个阶段恰是这两种细胞处于表观修饰最低水平的状态，如DNA甲基化修饰、组蛋白的甲基化修饰等（Sasaki H et al., 2008）。在诱导多功能干细胞（iPSC）中也发现有piRNA的存在。iPSC具有分化成各类细胞的潜能，其中表观修饰决定着细胞分化的命运，piRNA与染色体和DNA的表观修饰有关，通过参与这一过程，使得细胞向定向的方向进行分化（Wang Y et al ., 2014）。除了对基因组的转座子区域进行表观修饰，研究发现，在神经细胞中piRNA通过DNA甲基化影响神经突触的可塑性（Rajasethupathy, P et al., 2012）。 转录后水平调控 piRNA对基因的转录后水平调控不局限于转座子。果蝇卵巢、小鼠生殖组织、非洲爪蛙卵中发现一些编码蛋白的mRNA 3’ UTR区域同样可以产生piRNA。这些3’ UTR区域含有转座子重复序列，提示，piRNA具有调控mRNA水平的潜能（Robine, N et al., 2009）。多项实验证明，piRNA pathway 与 P-bodies 紧密相连，P-bodies 是一种胞质复合物-参与翻译调控。有研究报道，Ago3 、Aub和Tud 蛋白在生殖细胞中与P-bodies 蛋白发生共定位（Thomson, T et al., 2008）。在小鼠中也发现了类似的现象。Miwi和piRNA被发现和RNP组分相关(Grivna, ST et al., 2006）。以上实验现象揭示了PIWI-piRNA在转录后水平和翻译水平可能发挥重要作用。 PiRNA 与癌症研究进展 癌细胞和肿瘤组织中发生的基因变化受到一系列小分子的调控，其中包括非编码小RNA。有研究结果表明，PIWI-piRNA与癌症存在一定的相关性。 大量研究发现，人类PIWI蛋白在多种肿瘤中均有异常表达，如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等 （Lee JH et al., 2006 ; Zeng Y et al., 2011）。但是，PIWI蛋白的异常表达是如何影响肿瘤的临床特性却是未知的。尽管piRNA在癌症中还未被广泛研究，但是仅有的少数研究表明，癌症中piRNA表达谱发生了变化。乳腺癌中发现了数百个特异的piRNA序列，其中差异表达的有6个。采用RT-PCR技术在大样本中验证，证实其中4个确实发生了显著性变化（Huang G et al., 2013）。有报道表明，piR-823在胃癌组织中表达显著降低，并且表达水平与胃癌分期相关，piR-823水平上调会导致胃癌细胞生长抑制（ChengJ et al., 2011）。此外，胃癌患者外周血中piR-823明显低于对照组，说明piR-823具有作为胃癌诊断标志物的潜能。PiR-823也被证明和多发性骨髓瘤相关。有研究表明piR-823在多发性骨髓瘤中显著上调并与临床分期呈正相关。在多发性骨髓瘤细胞沉默piR-823诱导细胞凋亡相关蛋白表达，促进癌细胞死亡。进一步研究发现，piR-823通过表观修饰抑制抑癌基因的表达（Yan H et al., 2015）。piR651被发现也和胃癌相关。在胃癌组织中，piR651表达上调，上调水平也与胃癌分期相关。可作为胃癌诊断治疗的潜在靶点（Cheng J, et al., 2011）。 piRNA在肿瘤中异常表达的现象已多有报道，但有关piRNA调控肿瘤进展的机制研究较少。部分学者，根据piRNA在生殖系统中的研究结果对其在肿瘤中的机制进行了假设： （1）piRNA通过甲基化修饰的表观调节参与到肿瘤的形成中； （2）piRNA在转录后水平对编码蛋白的肿瘤相关mRNA进行降解； （3）piRNA与miRNA均为非编码小RNA，可能也具有与miRNA相似的作用。 目前的研究结果发现，piRNA在肿瘤中发挥作用的机制主要有两种形式：表观调控、细胞周期调控。 DNA甲基化异常、异染色质H3K9me3修饰及转座被发现参与到肿瘤进展中。人类淋巴瘤和乳腺癌细胞系中，单拷贝piRNA通过不完全结合到非转座子的靶标CpGs的基因组DNA上进行基因特异性的DNA 甲基化修饰（Fu, A et al., 2014）。进一步研究：使用带有rs1326306 SNP的piR-021285突变体转染乳腺癌细胞，发现，ARHGAP11A基因的第一个外显子的CpG岛甲基化水平显著降低。与转染野生型piRNA的细胞相比，piR-021285突变体增强了ARHGAP11A基因表达，因此癌细胞的迁移能力增强（Fu, A et al., 2015）。果蝇中，PiRNA 还可以通过上调亚端粒异染色质区域H3K4me3和抑制H3K27me3诱导常染色质状态来激活基因表达（Yin, H et al., 2007）。与这种机制相类似，类piRNA分子，位于生长抑制特异性基因（Growth Arrest Specific 5, GAS5）内含子区域，与PIWIL1/4一起招募hCMPASS类似复合物到肿瘤坏死因子家族TRALL的启动子区域从而激活TRLL的表达，抑制肿瘤生长（He, X et al., 2015）。 除了表观修饰，PiRNA也可以对细胞周期进行调控。在人类支气管上皮细胞系中敲除piR-L-163后，DNA合成加速，G2-M期转换加速，加快了细胞的侵袭和迁移能力（He, X et al., 2015）。进一步研究发现，piRNA-L-163与磷酸化的蛋白质ERM的结合是其发挥作用的重要形式，提示，piRNA在肺癌中的功能性作用。上述结果表明，piRNA在肿瘤中发挥功能性作用也可以以PIWI非依赖的形式进行。  广州永诺生物科技有限公司成立于2010年，总部位于广州国际生物岛，是一家专注于医学科学技术开发与服务、分子诊断产品研发与生产的高新技术企业。 公司目前占地面积近六千平方米，硕、博士以上学历员工占比近40%，已建立包括基因组高通量测序、分子细胞功能实验、病毒包装构建和动物疾病模型等在内的一整套研发、生产技术体系平台。 公司依托先进的技术力量以及具有竞争优势的人才储备，建成符合国家标准的SPF级实验动物中心及常规分子实验平台1000平方米、符合GMP标准的分子诊断试剂及产品车间2500平方米、医学检验实验室1000平方米、办公场所1000平方米。并于2017年获广东省卫生与计划生育委员会批准执业第三方医学检验所—广州永诺医学检验所，2018年获得广东省科技厅授予的实验动物使用许可证。 近年来，永诺生物顺应国家倡导的精准医学发展趋势，在自身技术平台及人才梯队的基础上，引进国际领先的ILLUMINA、Oxford Nanopore高通量测序平台，进一步优化医学诊断产业方向，构建高规格的肿瘤样本库与数据库，开发具有自主知识产权的基因捕获技术和大数据挖掘算法，精心研发出了国内领先的肿瘤早期诊断、感染疾病、心血管疾病风险筛查和个体化用药基因检测等系列产品，以期为广大患者带来福音。 在大力研发下游基因检测技术的同时，永诺生物也在分子诊断的上游提早布局，2017年10月，永诺生物旗下永诺医疗成功研发了国内首款拥有完全自主知识产权的微滴式数字PCR仪MicroDrop™并投入生产，是国内首款微滴式数字PCR检测系统。目前数字PCR仪器及配套试剂、数字PCR肿瘤液体活检试剂盒等正在申报医疗器械注册证，相信不久后，将替代进口产品成为数字PCR领域的翘楚。 |
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