组织透明成像技术

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大家好！我是专注显微在体/活体成像技术的疯狂成像CrazyImaging。我会定期邀请生命科学领域的“大牛”分享科普知识、前沿技术及应用等很多有意思的内容。

本期邀请到郑超、李晓煜、齐冬三位显微成像领域资深技术工程师，为大家分享最新的组织透明成像技术。

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为啥要组织成像

人类的认知过程从哲学上看都是由粗入细，再回到宏，这样的往复周期运行，期间总是伴随科技进步带来的推动。从分子细胞水平了解生物结构和过程后，科学家们自然而然的就会想从更宏观的尺度去研究细胞群，组织，甚至器官的生理病理过程和联系。制药也是这个哲学过程的良好体现，另一个例子就是对脑的结构和功能的深入研究。因此大型、厚组织成像就变成了一个顺理成章更上一层楼的技术要求。

组织成像的挑战和方法

显微镜作为眼见为实的最佳工具，在生物医学领域有着极为重要的作用。生物样品归根结底都是三维的，但是因为不透明组织或者厚尺度样品对光的散射，想要对深层组织成像是个很大的挑战。以往常用的办法就是先把厚的组织切成很多2-D的薄切片后再用显微镜看，这样做的缺点就是制样成像过程慢，破坏整体内部结构，重建繁琐不精确，样品损毁不可重复用。目前基于这种物理切片方法中，使用最先进成像系统（如fMOST）处理一整个鼠脑也需要一周多的时间。

过去一百多年，研究人员一直尝试使用各种办法使样品透明来减低光散射，以便可以直接整体观察，可是到近十年之前一直进展不大。技术原因有两个：光学显微镜本身和化学干扰引起的光学问题。

还有一种做法是不采用物理切片，而使用光学切片技术的整体成像，比如激光共聚焦显微镜，双光子显微镜和转盘显微镜等。但是这些现代的显微技术还是没办法解决的一个问题就是组织太厚，和由此带来的严重速度滞后和光漂白问题。

相比光学问题，化学问题更让人头痛。不同组织的厚样品产生影响观测的因素有: 1. 色素会吸收可见光，阻挡入射光和激发光，譬如血红蛋白，肌红蛋白，黑色素等。2. 由内源荧光分子(胶原，酪氨酸，黄素等)或者在制样过程中引入的荧光信号(戊二醛，多聚甲醛等)产生的背景信号。3.最后也是最重要的，绝大多数生物样品由于脂质的存在看起来都是乳白色或不透明的，缺乏透明度导致很难得到高信噪比的图像，也是做深层组织成像的最大障碍。这种不透明是由光的散射引起的，本应直线传播进入探测系统的光束在组织内部的分子、膜、细胞器、和细胞之间来回反射，散射，被吸收，导致信号极大损失至忽略的水平。

现代透明技术

光在同一介质里传播，方向是不会改变的。所以把组织内部的各种细胞器变成一致的折射系数或近乎一致的，就能解决前述技术难点，这也是现代透明技术的终极目的。透明化示例如下：

Mouse embryo and mouse brain before and after treatment with SeeDB

http://www./en/pr/press/2013/20130624_1/

由于不同样品千变万化的化学内环境，以及标记荧光分子在不同内环境中所表现的性质不同，不同透明化过程对不同样品的效果和形变也是不同的。这个领域大致可以分成两个方向: 1. 采用100多年前Spalteholz近似原理的脱水和基于溶剂的透明化方法，和2. 越来越流行的水基透明方法。水基透明方法又可分为3种：1). 被动式的把样品浸泡在折射系数匹配的溶剂里，2) 先移除油脂，再水化样品使剩余的组织折射系数降低，3) 主动或者被动的移除油脂，再把样品浸泡在折射系数匹配的溶剂里。

水基的透明化方法无毒，大部分不会使样品发生形变(一些会造成样品增大)，不会损伤浸入式显微镜镜头。但其透明化效果不好，只适用于小样品，其制样过程流程往往也非常复杂、不易操作，时程可以长达好几周。

溶剂的透明化往往能达到好得多的光学效果，譬如对于脂质丰富的脑来说是不二的选择。但其有些难闻，有一定毒性，会造成非特定设计的物镜损毁，也会使得某些样品缩小。一个主要的限制是脱水过程会移除对维持蛋白发光非常重要的水分子。随着透明化技术快速成体系的发展，不断改良的溶剂型透明化方法譬如3DISCO和iDISCO等方法可以极大改善此类问题，但是都还不完美。

主流透明化技术具体的比较可参见下表(Lichtman, 2016)。

https://www./action/showFullTableHTML?isHtml=true&tableId=tbl1&pii=S0092-8674%2815%2900837-5

（可点击最下阅读原文进入链接）

新的透明化技术在不断地出现来解决旧有技术的一些问题，新的透明化名词也层出不穷，如Pegasos，3DISCO, FluoClear, uDISCO, Scale, SeeDB, CLARITY, CUBIC, PACT, SWITCH, CUBIC-R, and Bone Clarity等等，如感兴趣请根据文末参考文件5-19去自行检索相关文章。另外除了对死（固定）样品做透明化外，还有研究组，如朱丹研究组对活小鼠颅骨尝试了透明化处理，感兴趣的朋友可以参考引用文献20。

透明化的步骤在此不具体讲解了，感兴趣的话其实可以专门开一篇文章，下图是个简单的透明化流程说明。

透明化组织成像

透明化技术的发展也在推动着成像技术的发展。目前常见的针对透明化样品的成像技术包括共聚焦、双光子以及光片显微成像技术.

共聚焦和双光子

在样品透明化之后，光的散射对成像造成的影响显著减弱，限制成像的主要因素就变成了显微镜的样品放置以及物镜的工作距离/NA值。目前大部分显微镜厂家都推出了超长工作距离(>5mm)，高NA值(>0.8)的物镜。所以共聚焦和双光子显微镜都可以应用于透明化样品成像。对于透明化样品，单光子共聚焦比双光子显微镜的优势更大一些，因为单光子的激发效率更高，对于多种染色的样品串色的可能性也更低。除非是样品透明化程度不高，或者需要使用近红外激发。

但是共聚焦和双光子成像的最大问题在于成像速度。一个1000mm³的鼠脑如果使用20x/1.0NA的物镜成像，需要>4200000张图片(假设500umx500um的视野，1um的步距)，在常见的1fps成像速度下，扫描整个鼠脑需要将近50天。所以共聚焦和双光子目前在透明化样品上还只能扫描小部分区域而不是整个样品。打个直观的比方，用共聚焦或双光子对数毫米甚至厘米级的样品成像就好比用手术刀去砍柴。

光片显微镜

光片显微镜的原理可参见本公众号之前的两篇文章——荧光光片显微成像(上篇)；荧光光片显微成像(下篇)。光片显微镜对透明化样品成像最大的优势在速度。不管是自搭建的或者商用化的光片显微镜，因为采用sCMOS相机进行面扫描成像，最少也能达到20fps的速度。Luxendo的MuVi-SPIM-CS(如下图)两个相机同时工作时可以达到全幅(2048x2048) 大于70fps的成像速度。例如常用条件下其只需4小时左右就能完成整个透明鼠脑的拍摄（单色，60毫秒曝光，100个视野，每个视野z轴2300层，z步进4微米，囊括整个样品）。

另外一个很大的优势是z轴分辨率，以前的光片显微镜采用柱面镜和低NA物镜生成光片，所以分辨率不高。随着新的光片显微镜技术的产生和成熟(振镜扫描或空间光调制模块产生光片、贝塞尔光片、晶格光片等)，分辨率已经不再是限制光片显微镜的因素。如果条件允许，在选用同样的成像物镜时，光片显微镜要比共聚焦的z轴分辨率高。更重要的是，因为光片显微镜可以从多角度扫描，再使用软件把图像融合，最终能生成xyz 3轴接近的分辨率，对于3D大样品的研究，尤其是透明化样品的研究提供了更好的工具.

上述是光片显微镜通用的优势，但是在和透明化相结合的应用中一开始不是很能发挥优势。原因在于上面讲过的1. 有机溶剂透明化试剂会损毁镜头。2. 需要大范围内匹配不同透明化试剂的折射系数。所以最初市场上的商业机有的只能做水型，不能做有机溶剂透明化，否则会损毁镜头。有的采用隔离玻璃防止损毁镜头，但这样会大大降低分辨率。随着研究需求的增加，市场上出现了一些可以校对溶液介质折射率的超长工作距离镜头， 比如MuVi-CS使用的两种物镜如下:

10x/0.5NA，工作距离 5.5mm，可通过物镜校正环适配折射系数1.33-1.51;

20x/1.0NA，工作距离 8mm，可通过物镜校正环适配折射系数1.44-1.50.

这样的物镜可以匹配目前几乎所有的透明化成像技术的溶液，而切通常不会损伤镜头。

最后一个现代成像技术中不可忽略的因素是科研大数据处理。以2k x 2k，16位sCMOS相机为例，每拍摄一张图片的文件大小就是8MB。以拍透明鼠脑为例，做10x10个视野拼接，每个视野的z为2300层，如果只拍摄一个荧光通道，相机就要产生1.8TB数据量。如果需要多色、多角度(比如0度和90度,来实现xyz 3轴同样的分辨率)，这个数据量还要翻好几倍。这就带来了3个挑战: 1) 如何应对每秒钟近千兆的瞬时大数据量写入？2) 如何存储这些大数据？3) 如何分析处理这些数据？这导致很多人都有过原始数据在手，却一两个星期拿不到哪怕最初结果的尴尬场面。

拷贝几百G的数据到移动硬盘都需要数小时，更不要说处理分析了。而且这不是简单配台好电脑就能解决的，而是涉及IT基建的问题，需要从数据结构，软硬件匹配架构，传输，储存，运算等综合考虑。这些问题现阶段可以通过组建专业的大型计算服务器在一定程度上解决，未来随着超算、云计算、量子计算机的飞速发展以及图像压缩技术的进步，这些问题有可能得到彻底解决。现阶段的商品化产品方面，Luxendo和Acquifer等都提供的专业的数据存储和处理方案，数据传输速度至少800MB/s(可高达2GB/s)，多达PB级的数据存储，采用RAID架构保证数据安全，以及使用支持GPU并行运算的算法进行图像融合以及分析。

以上简要分析，希望能够对大家了解和未来选择相关技术有所帮助。下面是近期我们在国内外通过MuVi-SPIM-CS获得的一些成像结果，请大家参考、留言共同探讨。

互成90°角的透明脑样品局部，从多个维度展示光片xy方向的成像分辨率，其成像分辨率高于传统共聚焦或双光子的Z方向分辨率。Sample courtesy of: Dr. Lin R, NIBS, Beijing, China 

透明脑样品约2mm样品Z方向的分辨率展示，Sample courtesy of: Dr. Lin R, NIBS, Beijing, China

Sample courtesy of: Dr. Zhong SL, NIBS, Beijing, China

小鼠卵巢透明化样品，Sample courtesy of: Dr. Zhang L, Fudan University, Shanghai, China

Sample courtesy of: Glenda Comai, Institute Pasteur, Paris, France

Sample courtesy of: Atsushi Miyawaki and Hiroshi Hama, RIEKN Center for Brain Science, Tokyo, Japan

Vasculature and GFP-expressing neuronal subsets in cerebral cortex of a GFP-M mouse (GFP-M mouse line, 14 weeks old). A (right) brain hemisphere was preserved in ScaleS4 reagent for one year at room temperature after clarification by using of ScaleS protocol. The temporal lobe was scanned (depth: 0–2mm, z-step: 1 um). The GFP-expressing neurons and the blood vessels labelled with Alexa Fluor 488 were widely visualized in the cerebral cortex.

Sample courtesy of: Atsushi Miyawaki and Hiroshi Hama, RIEKN Center for Brain Science, Tokyo, Japan

YFP-expressing neuronal subsets in cerebral cortex of YFP-H mouse (13 weeks old). A whole brain of YFP-H mouse was preserved in ScaleS4 reagent for 2.5 years at room temperature after clarification by using of ScaleS protocol. The (left) temporal lobe was scanned from the surface to the hippocampus (depth: 0-3mm, z-step: 1um). The individual neuronal soma with an apical dendrite in the cortical area was clearly visualized. 

Sample courtesy of: Jim Swoger, EMBL, Barcelona, Spain

Sample courtesy of: Miyawaki/Hama, Riken CBS, Japan

参考文献

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