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STEMCELL类器官巡讲现已圆满落幕，我们在杭州、上海、厦门、广州、济南、北京、沈阳、成都和南京举办了10场讲座，共有来自100多所单位的近600名老师参加了本次类器官巡讲，感谢各位老师的积极报名与参与！ 上海·好望角大酒店 北京·西单泛太平洋大酒店 济南·凯悦酒店 上期的小鼠肠类器官建立技术贴得到了各位同学老师的广泛好评，今天就给大家带来第二期 - 如何进行小鼠肠类器官的传代、冻存和复苏！ 第一部分：小鼠肠隐窝的分离和第二部分：小鼠肠类器官的建立培养请参考我们的上期微信哦！想要获得一份完整的小鼠肠类器官中文版操作手册？点击这里留下您的联系方式，我们会第一时间发送给您！ 小鼠肠类器官中文版操作手册（部分） 第三部分：小鼠肠类器官的传代 1. 在传代当天，从冰箱中取出预先制备好的IntestiCult™器官生长培养基，恢复至室温（15-25℃）。培养基在使用前必须恢复至室温，每孔需要4 mL完全培养基传代。配制完全培养基，请参阅本第一部分的第1步和第2步。 2. 培养基完全解冻后，加入适量的抗生素。我们推荐使用50 μg/mL庆大霉素或100 units/100 μg的青霉素/链霉素双抗。 3. 准备过程中所需的其他培养基，缓冲液和试剂。每孔需要150 μL Matrigel®基质（Corning® 产品号＃356231），在冰上解冻。将温和细胞解离试剂（产品号# 07174）和每孔所需要的10 mL含有15 mM HEPES的DMEM/F-12（产品号 #36254）置于冰上。将所需数量的TC处理的24孔培养板（Corning®产品号 ＃3526）置于37°C孵箱预热30分钟。 4. 在每个需要传代的类器官的孔中，小心吸出其中的培养基，不要破坏Matrigel® dome。 5. 每孔加入1 mL温和细胞解离试剂（GCDR，产品号 #07174），室温（15 - 25°C）孵育1分钟。 6. 使用GCDR预先湿润1000 μL的枪头，上下吹打20次，吹散凝固的dome。 7. 使用同一个枪头，将培养物转移到15 mL的离心管中。之后使用1 mL新鲜的GCDR润洗该培养孔，一并转移至15 mL的离心管中。 8. 其余需要传代的培养孔，重复第6步和第7步。 9. 在转速为20 rpm的摇床上室温（15 - 25°C）将以上15 mL的离心管孵育10分钟。 10. 以290 x g，2 - 8°C下离心5分钟，小心去除上清液。 11. 使用预先湿润的10 mL的移液管将细胞沉淀重悬于10 mL（2 - 8°C）冷的DMEM/F-12中，再以200 x g，2 - 8°C离心5分钟，小心吸出上清的DMEM/F-12，不要接触到细胞沉淀。 12. 每管加入150 μL室温的IntestiCult™类器官生长培养基。加入150 μL未稀释的Matrigel®基质后，上下吹打十次，重悬细胞沉淀。尽量避免产生气泡。 13. 从每个离心管，使用移液枪头吸取50 μL培养基/Matrigel®混合悬液，加至预热的24孔培养板其中一可孔的中心，以形成dome。 14. 将培养板的盖子盖好，在37°C下静置10分钟以待Matrigel®完全凝固。 15. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入750μL预热至室温（15 - 25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。不要将培养基从dome上直接加入。 16. 将无菌PBS加至其它未接种dome的孔中。 17. 将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％CO2下进行培养。 18. 每周进行三次完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘，小心地将原有液体培养基吸出，并加入750 μL新鲜的于室温（15 - 25°C）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。 使用此系统，类器官可被无限传代。 技术操作视频 - 如何进行小鼠小肠类器官的传代？ 第四部分：冻存小鼠肠类器官 本操作流程适用于每管冻存和复苏200个类器官。为达到最佳的结果，冻存应在类器官成熟后进行。 注意：肠类器官从原代建立后，至少应进行两次传代后才适宜进行冻存；为达到最佳效果，应使用成熟的并具有多芽的类器官。从小肠培养出的类器官通常在培养5-7天后达到成熟（图8A）。结肠类器官的成熟更加缓慢，萌芽也比较不明显，通常在培养7-10天到达成熟（图8B）。 1. 准备本操作流程中所需的所有培养基和试剂。将不含钙和镁离子的PBS（产品号 #37350），含15 mM HEPES的DMEM/F-12（产品号 #36524）和 CryoStor® CS10（产品号 #07930）置于冰上。将需要进行类器官冻存的培养板取出。 2. 使用倒置显微镜，对每孔的成熟类器官进行计数。为保证每管中含有200个类器官，可将几孔的培养物合并冻存。 3. 吸出培养孔中的IntestiCult™类器官生长培养基。加入1 mL冷的（2 - 8°C）PBS。 4. 使用PBS预先湿润1000 μL的枪头，上下吹打10 - 20次吹散Matrigel®基质。将含有200个类器官的混合物转移至1个15 mL的离心管，如需要可合并几个培养孔。 5. 使用预先湿润的1000 μL的枪头，将1 mL冷的（2 - 8°C）PBS加入每孔进行清洗，上下吹打5次，转移至第4步的离心管中。 6. 以290 x g，2 - 8°C离心5分钟。小心去除上清液，不要接触到沉淀的类器官。 7. 使用7 - 10 mL冰冷的含有15 mM HEPES的DMEM/F-12重悬类器官沉淀。轻柔的敲打离心管，或者使用枪头轻柔的吹打，吹散沉淀。再以200 x g，2 - 8°C离心5分钟，小心去除上清液。 8. 使用1 mL冰冷的（2 - 8°C）CryoStor® CS10重悬类器官沉淀，每管冻存200个类器官。 9. 使用同一个枪头，将含有类器官的CryoStor® CS10转移至预先标记好的冻存管中。将冻存管放入具有500 mL异丙醇的细胞冻存盒或不含IPA的冻存盒。 10. 将细胞冻存盒置于-80°C冰箱24小时后，将细胞冻存管转移至液氮（-135°C）中进行长期的储存。肠类器官可在-135°C下冻存6个月。不建议在-80°C进行长期储存。 注意：操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与CryoStor® CS10的接触时间。 图8. 光学显微镜10X物镜下的成熟肠类器官。类器官在1：1Matrigel® 基质和IntestiCult™生长培养基所形成的dome中进行培养培养条件为37°C和5%CO2。（A）培养5天后的小肠类器官和（B）培养10天后的结肠类器官。 第五部分：复苏小鼠肠类器官 1. 冰上解冻120 μL Matrigel®基质（Corning® 产品号 #356231），将预先配置好的完全IntestiCult™类器官生长培养基预热至室温（15 - 25°C）。24孔板的4个培养孔需要3.1 mL完全培养基。配制完全培养基，请参阅本第一部分的第1步和第2步。将所需的TC处理的24孔培养板（Corning®产品号 ＃3526）置于37°C孵箱预热30分钟。 2. 将2 mL的25% BSA母液与48 mL含有15 mM HEPES的DMEM/F-12（产品号 #36254）混合于一只50 mL的离心管中，用于配置含有1% BSA的DMEM/F-12清洗液。操作过程中，室温（15 - 25°C）保存。本清洗液可于2 - 8°C保存6个月。 3. 将2 mL 含有1% BSA的DMEM/F-12加至一个15 mL离心管中，放于室温（15 - 25°C）。 注意：为避免影响细胞活率，细胞应当马上转移至该离心管中。 4. 拿出冻存的类器官，置于37°C水浴中。当冻存液变为液体，解冻即完全，此时应在管底观测到类器官。在37°C解冻大概需要2 - 2.5分钟，培养物过热会影响类器官的复苏效率。 5. 打开前，使用70%酒精或异丙醇擦拭冻存管外部。使用1000 μL枪头将1 mL含有1% BSA的DMEM/F-12直接加入管中。上下吹打4次，将冻存管中的内容物混匀。立即使用预先湿润的1000 μL枪头将冻存管中的内容物转移至第3步的离心管中，即含有2 mL 1% BSA的DMEM/F-12。 6. 用1 mL含有1％BSA的DMEM/F-12将细胞冻存管清洗两次，然后转移到离心管中。务必清洗到细胞冻存管的整个内表面区域，包括盖子内部。 7. 以200 x g，2 - 8°C离心5分钟，去除CryoStor®CS10。小心去除上清液。避免产生气泡。如果离心后存在气泡，则在吸出上清液体之前，先小心地吸去气泡。 8. 使用200 μL枪头，加入100 μL室温（15 - 25°C）的完全IntestiCult™器官生长培养基重悬类器官。 9. 使用200 μL枪头加入100 μLMatrigel®。上下吹打5 -10次，混匀培养物，以确保整个样品的密度和粘度一致。避免产生气泡。 10. 使用预先湿润的200 μL枪头，吸取50μL，并加入到提前预热的24孔板其中四个孔中的中心部位。为了防止接种时出现气泡，在使用移液枪时指压到第一段（不要按到底部）。于37°C，5％CO2下孵育10分钟，使Matrigel®固化。 11. 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入750 μL预热至室温（15 -25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。不要将培养基从dome上直接加入。 12. 将无菌PBS加至其它未接种dome的孔中。 13. 将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％CO2下进行培养。每周进行三次完全换液。 14. 为了获得最佳结果，解冻后应对冻存的类器官进行两次传代。冷冻后，类器官生长变慢。类器官通常在传代后5 - 10天进行传代（图9）。通常类器官的生长速度应在一次传代后恢复（图9）。 注意：不建议将类器官暴露于连续复苏-冻存的循环中。 图9. 从冻存的类器官生成的肠类器官的光学显微镜成像。复苏的类器官在1：1的Matrigel® 基质和IntestiCult™类器官生长培养基所形成的dome中进行培养，培养条件为37°C和5% CO2。（A）第0代，培养后第5天；（B）第1代，培养后第6天。 IntestiCult™常见问题 Q：IntestiCult™类器官生长培养基可以在37°C水浴中，而不是在室温（15 - 25°C）下解冻吗？ A：分装好的IntestiCult™类器官生长培养基在使用前可使用37°C水浴解冻，但我们不建议重新冷冻使用此方法解冻的培养基。 Q：为什么隐窝的分离需要使用冰冷的DMEM/F-12，并在4°C下进行？ A：隐窝分离在4°C进行，会最大限度的降低对隐窝的损伤。 Q：切割的小肠片段可以大于2 mm吗？大小的范围是多少？ A：使用2 mm的肠段在本操作流程中可进行有效的清洗和隐窝的分离。较大的肠段可能需要更多次数的冲洗，且导致较低的隐窝回收率。 Q：可以对肠段使用离心而非重力沉降吗？如果可以，应使用多大的速度离心？ A：我们建议使用重力沉降，由于离心会导致有毒物质的沉降，降低隐窝分离效率和回收率。 Q：进行肠隐窝计数时，为什么多层的组织片段不应被计算？如果它们不是聚集的隐窝，那会是什么呢？ A：大块的、多层的组织片段很有可能是组织碎片，在肠隐窝分离过程中未被去除。这些片段通常不具有干细胞，所以不会发育成为类器官。这些片段通常会在早期的隐窝组分中出现，使用后面的组分会消除大部分这些多层组织结构的困扰。 Q：在进行小鼠小肠隐窝分离时的第5步为什么不能使用冷的IntestiCult™培养基？如果不小心使用了冷的培养基该怎么办？ A：由于冷的培养基会融化基质，所以必须使用室温培养基混合肠隐窝和Matrigel®基质。如果不小心使用了未预热到室温的培养基，等待混合物预热至室温后再在预热的24孔板上进行接种domes。注意一旦培养基和Matrigel®基质一旦混合，它们开始凝固，所以动作需要快速于。4个培养孔的接种时间应在30 - 60秒内完成。如果培养孔还不能进行接种，将混合物短暂置于冰上会再度降低黏度。 Q：在第三部分：传代小鼠肠类器官的操作流程中的第11步，如果使用了预热的DMEM/F-12怎么办？ A：我们推荐使用冷的DMEM/F-12去清洗解离后的类器官沉淀。使用预热的培养基会导致细胞在清洗过程中损伤，降低回收率。 Q：如果每孔中接种的类器官密度高于或低于推荐的200个类器官每孔，怎么办？ A：相邻生长的类器官的生长情况会比较好，但是接种密度太高会造成培养物压力过大。我们不建议每孔的接种密度超过200个类器官，但有证据显示，即使在每孔接种400个类器官的情况下，培养物会在两代内恢复（图10）。类器官接种密度过稀亦可在一次传代后恢复。 Q：如果类器官在冻存前/后破碎了，类器官是否会恢复？ A：只要培养物中具有健康或单个的肠干细胞，已经破碎的类器官可以在一代后恢复（图11）。这些类器官通常需要额外3 - 5天重新构建，且需要进行数次传代后才能生成足够数量的类器官。 图10. 从冻存的类器官进行肠类器官培养。接种密度过高的状态。400个冻存的类器官复苏后接种到一个50 μL的1：1的Matrigel® 基质和IntestiCult™类器官生长培养基所形成的dome，培养条件为37°C 和 5% CO2下。（A）第0代，培养第5天和（B）第1代，培养第6天。 图11. 从已经破碎的冻存类器官或冻存后破碎的类器官中生成的肠类器官的光学显微镜成像。类器官培养于1：1的Matrigel® 基质和IntestiCult™类器官生长培养基所形成的domes，培养条件为于37°C 和 5% CO2。（A）第0代，培养第5天和（B）第1代，培养第6天
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类器官专题下一期，给大家带来-如何进行类器官的荧光染色！敬请期待！
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