二代测序：精准治疗时代

       目前人类基因组大概有2万多个基因，大约有80%都在脑内表达。目前的遗传性疾病中，有超过5000种是已知其分子改变基础。其中有40%累及大脑或神经系统。以往采取的是第一代测序技术，只能在PCR扩增基因后才能测序，通量小，测序成本高，数据分析量大，无法完成全基因组层面的分析，检测时间长，临床使用受到限制。而目前第二代测序技术逐渐在临床中得以应用。其在很短时间内能完成上百亿个碱基对的测序，高通量，低成本，自动化程度高，是对传统测序技术的一次革命性的改变，为神经科精准治疗提供了强大的武器支持。

全外显子测序

      全外显子测序是主要测定基因的负责蛋白质编码的部分，只占整个基因组碱基对的1-2%，然而，却集中了目前遗传性疾病的绝大部分已知突变。全外显子测序可以诊断几乎全部神经科不同种类的遗传性疾病。采用全外显子基因技术可一次监测超过5000种神经科不同基因型的疾病。其原理是采用序列捕获技术将全基因组外显子区域的DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，是一种选择基因组序列的高效方法。其试验流程是：基因组DNA制备和检测→构建片段文库→目标片段的富集→富集文库的扩增→文库质量的检测→高通量测序

      全外显子测序的在神经科不同疾病的阳性诊断率

变异的识别和筛选

    不同于第一代测序技术，二代测序技术需要复杂大量的生物学计算过程。目前所采用的参考基因组来源于13个匿名的捐赠者，病人的基因和参考基因做排列对比，任何与参考基因不同的变异都会标注，从而产生一个变异列表。平均外显子检测可以检测出30000个变异，而全基因组检测可以检测出几百万个变异。这几万个变异不一定都与临床疾病相关。所以测序后还需进行变异的识别和筛选，筛选出真正可能和疾病相关的变异。

      进行筛选的第一步就是和健康人群对照相比对。我们可以假设健康人群对照者中出现致病变异的几率很低或者基本没有。所以我们要对比这个变异在正常人群中出现的几率。一般当这种变异的突变几率在正常人群中超过1%，就可以认为这种变异属于基因多态性，一般不具有致病性。当变异在正常人群中小于0.1%，这种变异可能为致病变异。对于这种健康人群数据比对，西方国家已经建立了多个基因数据库，存放了数万名受检者的海量基因信息，可以提供变异比对的服务。

 基因变异的临床解释

       基因变异的临床解释非常重要。测试出的临床变异和临床表现有无必然的联系非常重要。错误的解释可能导致严重的后果，因此临床解释必须非常严格。比如，在一些癌症的领域，错误的解释可能导致不恰当的手术策略和监测措施。在日常工作中，只有认为基因变异确定与临床表现存在联系才能报告。

     一般来说，临床解释总是以突变频率评估作为开始，但是单纯依赖突变频率也可能会导致错误的结论。比如，遗传性痉挛性截瘫被认为是与SPG7基因变异相关。在这个基因上的一种突变1529C→T按照在人群的突变频率可以被解释为基因多态性，然而，根据基因数据库的数据，这个变异还是和遗传性痉挛性截瘫的表型相关，表明这一突变是致病性的。

    西方国家推出了一些关于基因变异临床解释的共识和指南。这些共识和指南中包括的内容有：表型的详细资料，遗传方式，突变机制，蛋白的结构和功能，在文献和人群中基因和疾病关联的证据等等。突变按照此分类为：致病突变，可能致病突变，意义未确定，可能非致病突变，非致病突变。

全外显子检测的局限性

       在神经系统遗传性疾病中，表型和基因测序的诊断符合率不到40%。有以下一些原因。首先一点，一些被认为是遗传性疾病的患者其实是获得性的一些疾病。其次，是全外显子测序技术上的原因。测序覆盖的深度不完全，捕获效率低，存在问题的基因本身是比较难测序的区域，比如富含GC的区域等等。第三，一些突变类型，比如重复扩增，复合拷贝数量突变，引起染色体结构异常的突变等等，很难通过全外显子检测来识别。需要一些特殊的检测手段。第四，发生在非编码区，也就是发生在非外显子区域的突变也不能通过全外显子检测来检测。

基于二代测序的基因靶向测序

     为了提升效率和减少成本，基因靶向测序就是在二代测序基础上，重点关注最有可能和疾病或表型相联系的基因。最初的手段是捕获比较感兴趣的基因区域，目前的手段是采用检测板检测的方法。这种方法是整个基因都被测序，但只有实验室制备的特异性的检测板的基因才会被分析。这种方法的优势就是提升了测序的性价比。从临床上说，这种方法也避免了临床过度分析无关基因突变的意义。

全基因组测序

    一些实验室已经开始全基因组测序从而代替全外显子测序。全基因组测序检测全部30亿个碱基对，包括外显子区和非编码区。而全外显子测序只检测占全部基因组1%的编码蛋白质的区域。外显子是基因组中重要的核心功能区域，而不编码蛋白质的区域过去被认为不发挥任何作用。越来越多的证据表明非编码区对外显子功能起重要的调控作用。

  全基因组测序有很多优点。 引起对于多代基因异常，或者涉及基因调节异常，比如转录异常等等，全基因组测序有重要的作用。对于单纯外显子测序难以检测的突变，比如染色体结构改变，拷贝数量突变等等，有更高的敏感性。

   尽管全基因组检测有很多优点，但是此项检测的变异多位于非编码区或内含子区，都是基因调控表达的区域。这些位置的变异很难评估是否与临床表型相关联。可能需要补充RNA转录的数据分析。

     遗传病的基因诊断策略

    医学的发展薪火相传。从远古的症状水平，逐步发展为解刨水平，影像，电生理水平，再到后来的细胞，蛋白水平，目前已经走进了基因水平。精准医学的大幕正在徐徐拉开，为今后疾病的诊断和治疗提供了更大的舞台。更多的检测手段，更好的技术，为今后基因治疗的发展提供了更大的可能性。逆水行走，大浪淘沙，神经科医生，我们做好了在这片舞台上起舞的准备了吗？

参考文献：

1，Rexach JLee HMartinez-Agosto JANémeth AHFogel BL，Clinical application of next-generation sequencing to the practice of neurology.The Lancet. Neurology 2019 May; 18(5):492-503

2，Guo Y . Sequencing technology in gene diagnosis and its application[J]. Hereditas, 2014, 36(11):1121.