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今天很荣幸和各位老师一起探讨一下关于癫痫基因检测的一些简单知识。 这次主要从以下三个方面进行简单的介绍：癫痫的简单介绍，以及癫痫疾病为何适宜进行基因检测，全外显子组测序对于癫痫疾病辅助诊疗的意义。 癫痫是一种由多种病因引起的慢性脑部疾病，以脑神经元过度放电导致反复性、发作性和短暂性的中枢神经系统功能失常为特征，是神经内科最常见的疾病之一。癫痫在任何年龄、地区和种族的人群中都有发病，但以儿童和青少年发病率较高。国内流行病学资料显示，我国癫痫的患病率（Prevalence）在 4‰到 7‰之间，每年有 40万左右新发癫痫患者。 目前临床中癫痫的诊断方法基本包括：病史资料 --体格检查 --辅助检查（ 脑电图（EEG）、 神经影像学、血液检查、尿液检查、脑脊液检查、心电图和基因检测），随着高通量测序技术的发展及应用，越来越多的癫痫致病基因被发现，而基因检测技术也已经成为重要的辅助诊断手段之一。 2017年国际抗癫痫联盟中的癫痫分类提出六大病因：遗传性、结构性、感染性、免疫性、代谢性、未知病因。每名患者可以有单个或多个病因。但是归总起来，癫痫的发生是内在遗传因素和外界环境因素在个体内相互作用的结果，每个癫痫病人的病因学均包括这两种因素，只不过各自所占的比例不同。 癫痫的遗传学病因主要有四种表现形式：单基因遗传性癫痫、多基因遗传性癫痫、遗传性多系统疾病中的癫痫、细胞（染色体）遗传异常所致的癫痫。遗传因素是导致癫痫，尤其是经典的特发性癫痫的重要原因。分子遗传学研究发现，大部分遗传性癫痫的分子机制为离子通道或相关分子的结构或功能改变。 目前，已知的癫痫相关致病突变主要有以下几种类型，SNV、InDel和CNV，而根据这几种突变类型，现在常用的基因检测手段如下： 全基因组测序（Whole Genome Sequencing）是将整个人体基因组测通，测序深度一般是在30X左右，这样一个人的全基因组数据量约为90~100G，数据量大，涵盖的信息全，适应于各种变异类型的检测，但是由于其成本较高，故限制了其在临床上的应用。
全外显子组测序和基因panel是目前临床中应用最多的癫痫基因检测手段，其具体的技术区别我们上一次的课程中有所提及。全外显子组测序筛查全面，阳性率、准确率高，可发现新的疾病致病基因或新发突变位点，一次测序，可进行多维度数据解析的优点。基因panel是根据已知致病基因位点设计，具有成本低，售价低的优势，但这也是其局限性所在，阳性致病基因检出率低且数据缺乏后续的科研价值。
CNV结构变异在癫痫疾病中所占的比例不高，对于一些存在CNV变异的疾病种类，比如Dravet综合征中比较常见的SCN1A基因的大片段变异，Rett综合征中常见的MECP2基因的大片段变异等，我们可以选用MLPA的检测手段。但当我们没有明确怀疑的致病基因，想在全基因组范围内筛查拷贝数变异，那么低倍的全基因组测序或芯片是我们可选的检测技术。
一代测序技术可以说是测序领域的golden standard，使用该种检测技术来验证二代测序中检测到的阳性致病位点，可以保证检测报告的阳性结果，而对于父母没有进行二代测序的情况，也可以使用该种检测技术来确保检测结果的遗传模式是否相符等。
下边主要介绍一下全外显子组测序在癫痫疾病中的应用。 癫痫患者使用全外显子组测序手段进行基因检测的一个重要目的即是辅助医生对癫痫患者的临床诊断。 与癫痫相关的疾病种类多，表型复杂，有些难以区分。目前很多癫痫综合征已经有了明确的致病基因，对于患者样本进行基因检测，可有助于临床医生进行辅助确诊。部分常见的与遗传相关的癫痫综合征如这张表格所示。 其他常见的与癫痫相关的先天遗传性疾病如表所示。 这些疾病目前已有比较明确的分子层面的致病机理，使用WES的手段对于这些疾病进行分子层面的确诊，有助于辅助医生区分相似表型的不同疾病，明确诊断。 使用全外显子组测序的另一个优势是，可以有效的检测出癫痫患者中高比例的denovo突变。 Ambry Genetics 实验室依次接收了1131例患有神经发育疾病的患者并进行全外显测序。根据是否表现癫痫，这些患者被分为2组：癫痫组（314人）和非癫痫组（817人）。 癫痫组314名患者中，有119人通过WES做出了确诊，诊断率为38%。其中，癫痫性脑病的诊断率更高（43.4%）。非癫痫组817名病人中，有229人通过WES做出了确诊，诊断率为28%。癫痫组的诊断率显著高于非癫痫组患者。 研究者对两组中致病基因的遗传模式进行了分析，在两组中，检测到的遗传模式共分为4种，常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁隐性和X-连锁显性。两组中，大部分确诊患者的致病基因表现为Denovo突变，这种倾向在常染色体显性遗传模式中更为明显。在所有阳性的检出结果当中，denovo突变约占75%。
在这1131个患者当中，使用全外显子组测序手段共检测到与患者表型相关的200个基因，而在这200个基因当中，共有14个基因是通过本次研究新确定的新的基因-疾病关联。 研究者在14个癫痫患者中发现了14个新的遗传病因，其中9个发现于癫痫性脑病患者。虽然这类基因还未有明确报道参与致病，但是鉴于新基因功能鉴定日益加速，研究者搜索别的有相似临床表型的患者研究，最终发现有3个基因随后被报道参与了癫痫致病。 这也证明了使用全外显子组测序发现新遗传病因策略的有效性。
癫痫致病基因与表型的关系复杂多样。同一个致病基因的不同位点突变可对应不同的疾病表型，而同一疾病表现型也可以对应不同的致病基因。比如SCN1A基因其所致疾病从热性惊厥、表型较轻的遗传性癫痫伴热性惊厥附加症，到严重的Dravet综合征等，所涵盖的疾病范围不仅仅局限于癫痫，在其他先天性遗传性疾病如家族性偏瘫型偏头痛等中亦有表现。
总之使用全外显子组测序手段对于辅助医生明确患者的临床诊断，发现分子层面的致病原因，甚至是发现新的致病机理都有其独有的技术优势。
全外显子组测序的另一个作用在于帮助医生选取合适的治疗措施。
目前在很多种类的癫痫治疗中，基因检测的结果已经可以帮助临床医生快速准确的做出治疗决策。比如若患者检出SLC2A1的致病基因突变，突变位点对应葡萄糖转运蛋白1缺乏综合征的患者，通常会对生酮饮食有反应。表中列出了部分具有可选治疗措施的基因及对应的疾病表型。使用WES的基因检测手段，可以辅助医师选择合适的治疗方案以及针对性药物，提供治疗思路，并把握治疗时机。
这是2014年发表在nature上的一篇关于使用全外显子组测序辅助癫痫患者治疗的一篇经典案例。Savannah是一名癫痫患者，两岁开始出现第一次癫痫发作，而后情况越来越严重，30天的发作次数已经高达300次。病因不明，药物难治性。使用全外显子组测序技术发现了25个最为可能的与离子通道相关的基因突变，推测变异主要导致了过多的钙离子进入到了细胞内。
母亲和其主治医生根据测序的结果，选择了一种钙通道阻滞剂的药物：维拉帕米，FDA批准用于治疗心律失常的药物，非抗癫痫药品。 治疗效果：癫痫发作：服药一个月，Savannah的癫痫发作在该月内就降到了50次，并且截止2014年（该文章报道时间），发作次数已经稳定在20-25次/月。智力发育也有了大幅的进步，服药之前挣扎着可说一个单词，到2014年已经能轻易的说出含10-15个单词的句子。
临床上通常依据癫痫发作类型或者癫痫综合征类别来选药，而准确的基因检测可以给临床医生提供更直接更精准的用药指导和禁忌药物。如东亚人群中对卡马西平的使用： HLA-B*15:02遗传药理学筛选可以预防卡马西平诱导史蒂文斯约翰逊综合征。
全外显子组测序的另一优势，就是这项技术带来的以后的附加价值。由于全外显子组是检测人体中所有的基因的外显区，故对于ACMG指南建议的，危害性大且具有提前干预的预防性措施的疾病补充发现（详情可见上次课程），甚至是其他系统，比如肿瘤、呼吸、内分泌等系统的疾病也可以使用相同的数据进行数据分析，实现一次测序终生受用的目的。
随着科研一直创新，新的与癫痫相关的致病机理不断发现，若现在我们的解读结果是阴性，随着数据库的不断更新，我们也可以使用同一数据进行重新分析。
下边用一个我们公司分析过的实例，简单介绍一下全外显子组测序的一个简要流程。
祖孙三代中，奶奶患有癫痫，爷爷是正常的。其中大儿子、小儿子、大孙子都是癫痫患者。小孙子，现年一岁半，目前还没有发病。所以家里比较担心这个小孙子，会不会也是癫痫患者，并会在日后发病。
这是对应的患者的临床病例信息。
我们采集了奶奶，两个儿子，两个孙子，以及爷爷（对照）的血液样本，选用安捷伦V6的捕获平台，HiseqX ten PE150的测序策略。得到的全外显子组数据如图所示，每个样本的cleandata均大于10G，Q30:>92%。
随后即可进入生物信息分析的环节，分析的简要流程如图所示（关于全外显子组测序分析的具体流程，会在下节课程中进行介绍）。生信分析之后于各样本中检测到的变异数目如表所示。
随后经过ExAC、1000G、ClinVar、HGMD、OMIM等最新数据库对突变进行比对并参考SIFT、PolyPhen2、LRT、MutationTaster、MutationAssessor、FATHMM、REVEL、MCAP等基于不同算法的多种软件进行突变位点功能预测；以及对于trios数据根据家系遗传情况进行基因型筛选之后，我们定位到一个致病基因突变:LGI1。
LGI1基因的第chr10-955373..处T碱基发生缺失，造成了移码突变，导致编码蛋白功能丧失。LGI1蛋白由突触前分泌并与突触后ADAM22结合。结合ADAM22结果改变细胞内信号的值，可能通过突触后谷氨酸受体亚基的变化，来降低兴奋性。LGI1基因突变导致不能与ADAM22结合，从而使神经网络兴奋性增加。 LGI1基因突变导致的内侧颞叶癫痫，其癫痫表型症状为听觉功能失常并由感觉性失语，属于常染色体显性遗传。复杂部分性发作或继发全身性发作。该基因突变导致的癫痫发作症状与患者的发作症状吻合，遗传模式也吻合。 庆幸的是，小孙子的血液样本中我们该基因的该位点没有发生突变。
检测报告中除会给出检测的阳性致病基因及对应的检测疾病表型之外，我们也会客观参考文献报道信息，将对应的与该基因位点相应的治疗建议附在报告当中。
在使用二代测序确定阳性致病基因位点之后，我们会对先证者和父母的样本进行一代测序验证以确保阳性结果。
以上是关于全外显子组测序在癫痫疾病中的应用，包括癫痫疾病为何适宜进行基因检测，以及全外显子组测序对于癫痫疾病辅助诊疗的意义。 下节课我们很荣幸邀请到了付凤丽博士来为我们进行讲课。付凤丽老师毕业于爱荷华州立大学生物信息学和计算生物学专业。博士毕业后她就职于美国明尼苏达大学，主要从事各种生物大数据的分析。付凤丽老师在攻读博士学位和工作期间，曾在nature及其子刊发表多篇学术论文。 下次课程中会介绍全外显子组数据生物信息分析简介，包括全外显子组数据分析的基本概念，全外显子组数据分析的流程介绍 ，全外显子组变异筛选简介。
感谢各位老师在百忙之中抽出时间收听我们这次课程。下面我们进入提问环节，各位老师有任何相关问题，都欢迎您在群内提出，我们共同进行交流。
1.第12张幻灯片中，您提到了检测到了14个和疾病相关的新的关联基因，请问这个新的疾病关联基因是如何评估的？
答：新遗传病因的分析依照内部制定的评估准则，评估支持证据如：人类微缺失/重复综合征、基因功能和表达谱、与有相似表型的已知致病基因的共定位和相互关系、体内动物模型、基因家族、信号通路信息、从对照人群里的突变分布推断出的可能的突变机制。
2.您提到的若患者检出SLC2A1的致病基因突变，对应葡萄糖转运蛋白1缺乏综合征的患者，通常会对生酮饮食有反应。是所有检测到SLC2A1基因突变的患者都适合生酮饮食吗？ 答：不是的，OMIM数据库中记录目前已知的与SLC2A1基因突变相关的疾病有：
而clinvar数据库中SLC2A1基因已知与疾病相关的突变位点数目有245个，我们要根据具体检测到的突变位点和其对应的疾病，选择相对应的治疗措施，具体问题具体分析。
3.使用基因检测手段进行患者的辅助诊断，不同年龄段的患者，阳性诊断率会有区别吗？
这次PPT中提到的那篇文章中有相关的研究显示，相比于后期发病者，WES在早期发病的患者中诊断率较高，新生儿期（28天以内）发病和婴儿期（1岁以内）发病的癫痫性脑病患者的诊断率分别为58.3%和41.8%。
4.有没有这样的情况发生，检测到一个基因突变，根据此基因突变的位置到NCBI去查找，发现这个基因突变的位置不是该突变基因。 答：首先检查一下，用的参考基因组是否一致？hg19 vs hg38？还有转录本是否一致？
5.临床中会遇到很多癫痫患者，服用癫痫药物之后出现不良反应，这个通过基因检测会有提示吗？ 答：我们的检测报告中，如果检测到阳性的致病基因信息，技术人员会参考文献信息，将与该基因位点对应的适合的治疗方案，无效的治疗方案和有不良反应的治疗方案均附在报告当中。所以该患者如果还没服用任何药物的话，医生可以参考我们的结果选择治疗方案。而如果已经出现不良反应的话，通过基因检查的手段我们可以查找一下患病原因以及出现不良反应的原因，并辅助医生选择合适的治疗方案。
6.一代测序、二代测序的区别是？ 答：二代测序技术是现在所说的高通量测序技术，可以在短时间内对很多样本同时进行测序分析，检测的准确率也很高。一代测序技术，我们现在常说的是sanger测序，准确率极高，但是他的检测周期长，花费高，所以不适宜于高通量的检测。通常我们都是用一代测序技术来验证二代中检测到的阳性致病位点。
7.WES测序是否可不用再做MLPA,CMA？WES检测是像panel一样，先做先证者的基因，然后再用父母的做一代验证呢?还是先证者和父母同时都要做WES? 答：1. WES数据用来分析CNV，一直存在争议。2. 父母加先证者(trio)同时WES数据，大大增加了call点的可信度，尤其对denovo突变的发现
8.请问panel的致病位点怎么选？是所有已报道的位点还是也包括了通过生物信息预测可能致病的位点？ 答：panel设计主要针对一些已知的疾病相关基因及其热点突变。
9.panel做出阳性位点，但是这个位点却没有报道过，这个怎么理解？ 答：panel设计的基因也有一定的覆盖区域，不只局限于位点。但在设计上会偏重于Hotspot的。发现的突变位点需要具体分析突变性质来解读是否致病。
10.WES能覆盖线粒体基因么？ 答：不能的，线粒体基因需要单测。
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来自： xiongzhang2017 > 《生物信息》
